Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thư da và mối liên quan của nó với các thể bệnh
10,312
170
140
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc mô học của da [6]
............................................................... 3
Hình 1.2. Các con đường tín hiệu trong ung thư [27].
.................................... 13
Hình 1.3. Con đường tín hiệu RAS/MAPK từ EGFR [27]. ............................
14
Hình 1.4. Sơ đồ vị trí, cấu trúc gen TP53 và sơ đồ protein p53
..................... 19
Hình 1.5. Vai trò của gen TP53 trong chu kỳ tế bào
...................................... 21
Hình 1.6. Vai trò của gen TP53 trong quá trình phân bào [37]
...................... 24
Hình 1.7. Tỷ lệ đột biến gen TP53 trong một số loại ung thư [48]
................ 26
Hình 1.8. Vị trí gen BRAF trên nhiễm sắc thể số 7 [52].
................................ 28
Hình 1.9. Con đường tín hiệu MAPK
............................................................. 32
Hình 1.10. Nguyên lý giải trình tự gen trên máy giải trình tự gen tự động ....
35
Hình 1.11. Sơ đồ phương pháp hóa mô miễn dịch với phức hợp Avidin -
Biotin
...............................................................................................
42
Hình 2.1. Máy đo quang phổ Nanodrop 2000
................................................ 47
Hình 2.2. Chuẩn bị thạch, điện di DNA và hệ thống UVP chụp ảnh gel sau
khi điện
di........................................................................................
49
Hình 2.3. Máy xác định trình tự gen ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer .... 51
Hình 3.1. Sản phẩm PCR được khuếch đại từ exon 2 4 (611bp)................. 57
Hình 3.2. Sản phẩm PCR được khuếch đại từ exon 5 6 (378bp)................. 58
Hình 3.3. Sản phẩm PCR được khuếch đại từ exon 7 9 (755bp)................. 58
Hình 3.4. Biến đổi g.11827G>C ở IVS1
......................................................... 61
Hình 3.5. Biến đổi g.11818-11819insC ở IVS1
.............................................. 61
Hình 3.6. Biến đổi g.11874-11875insC ở IVS1
.............................................. 62
Hình 3.7. Đột biến g.12319C>A (c.215C>A) ở exon 3
.................................. 62
Hình 3.8. Đột biến kép g.14060G>T và g.14062C>A
.................................... 63
Hình 3.9. Đột biến g.13150C>T và g.13151C>T (g.13150C>T) ở exon 4 .... 63
Hình 3.10. Biến đổi g.14177G>T ở IVS6
....................................................... 64
Hình 3.11. Biến đổi g.14242T>C và 14243T>C (g.14242TT>CC) ở IVS6 .. 64
Hình 3.12. Biến đổi g.14251-14252insG ở IVS6
........................................... 65
Hình 3.13. Hình ảnh biểu lộ protein p53 âm tính (độ phóng đại 200 lần) ..... 72
Hình 3.14. Hình ảnh biểu lộ protein p53 dương tính (+) (độ phóng đại 200
lần)
..................................................................................................
72
Hình 3.15. Hình ảnh biểu lộ protein p53 dương tính (++) (độ phóng đại 200
lần)
..................................................................................................
73
Hình 3.16. Hình ảnh biểu lộ protein p53 dương tính (+++) (độ phóng đại 200
lần)
..................................................................................................
73
Hình 3.17. Sản phẩm PCR được khuếch đại từ gen BRAF (171bp) ............... 75
Hình 3.18. Trình tự ngược chiều (reverse) gen phân tích của các mẫu ung thư
da
.....................................................................................................
76
Hình 3.19. Hình sắp xếp nucleotid của gen BRAF ở các mẫu ung thư da ...... 76
Hình 3.20. Đột biến gen BRAF (V600E) ở bệnh nhân ung thư tế bào hắc tố77
Hình 3.21. Hình ảnh nhuộm HMMD có kết quả đột biến BRAF(V600E) âm
tính (độ phóng đại 200 lần).
............................................................ 77
Hình 3.22. Hình ảnh nhuộm HMMD có kết quả đột biến BRAF(V600E)
dương tính (độ phóng đại 400 lần)
................................................. 78
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
CDK
CS
DNA
DSB
GF
HMMD
KN
KT
MPAK
NST
RNA
SSB
TB
TP53
UT
UV
Cyclin dependent kinase
Deoxyribonucleic acid
Double strand break
Growth factor
Mitogen Activated Protein
Kinase
Ribonucleic acid
Single strand break
Tumor protein p53
Ultra violet
Kinase phụ thuộc cyclin
Cộng sự
A xít Deoxyribonucleic
Đứt sợi kép
Yếu tố tăng trưởng
Hóa mô miễn dịch
Kháng nguyên
Kháng thể
Con đường tín hiệu
protein kinase hoạt hóa
phân bào
Nhiễm sắc thể
A xít Ribonucleic
Đứt sợi đơn
Tế bào
Protein khối u p53
Ung thư
Tia cực tím
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh ung thư ngày càng có xu hướng gia tăng trong những thập niên
gần đây. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, hàng năm trên toàn cầu có
khoảng trên 17 triệu người mắc bệnh ung thư và khoảng trên 9 triệu người
chết do căn bệnh này [1]. Ở nước ta, theo ghi nhận sơ bộ ở Hà Nội, thành phố
Hồ Chí Minh và một số tỉnh thành khác, ước tính mỗi năm có khoảng 150.000
trường hợp mắc mới và khoảng 75.000 người chết vì ung thư. Tuy nhiên,
nhiều căn bệnh ung thư vẫn có thể chữa trị được nếu được phát hiện sớm và
điều trị kịp thời. Người mắc bệnh ung thư có thể kéo dài thời gian sống, nâng
cao chất lượng cuộc sống nếu có được phương pháp điều trị phù hợp và tận
gốc [2].
Chính vì thế, việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh sinh ung thư, cũng
như cơ chế ức chế tế bào ung thư phát triển để từ đó tìm ra phương pháp điều
trị can thiệp là mối quan tâm hàng đầu của các nhà Y-Sinh học hiện nay. Trong
khuynh hướng nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh ung thư nói chung và ung thư
da nói riêng, các nhà khoa học đi theo hướng tiếp cận chính là nghiên cứu về di
truyền phân tử nhằm tìm ra các gen gây ung thư hay các tổn thương của hệ di
truyền tế bào do các tác nhân tại chỗ hay các tác nhân bên ngoài. Các tác nhân
này được truyền vào trong nhân tế bào thông qua các con đường tín hiệu, qua
một loạt phản ứng dây chuyền để tác động lên quá trình sao chép DNA và qua
đó tham gia điều hòa sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Một trong những con
đường tín hiệu đó là MAPK (mitogen activated protein kinase), cũng trong con
đường này các tác giả đã phát hiện được nhiều đột biến đặc biệt là đột biến gen
BRAF. Đột biến gen BRAF đã được phát hiện ở hầu hết các mô ung thư da và
có tỷ lệ cao trong ung thư tế bào hắc tố [3], [4], [5], đặc biệt là đột biến
V600E.
Nghiên cứu đột biến gen BRAF trong mô ung thư không những góp phần tìm
cơ chế gây ung thư mà còn giúp tìm ra liệu pháp điều trị mới, liệu pháp can
2
thiệp vào con đường dẫn truyền tín hiệu giúp kiểm soát ung thư một cách triệt
để hơn.
Trong hàng loạt các tác nhân gây biến đổi làm rối loạn phân bào, tăng
sinh không giới hạn và rối loạn biệt hóa tế bào thì cơ thể cũng có những cơ chế
bảo vệ chống lại sự rối loạn đó. Một trong các yếu tố đó chính là protein p53
do gen TP53 mã hóa có hoạt tính chống sự tăng sinh tế bào, sửa chữa các DNA
tổn thương, ngăn cản sự đột biến tế bào chống biến chuyển ác tính và trong
một số trường hợp gây chết tế bào theo chương trình. Khi có các đột biến xảy
ra có thể làm mất chức năng của gen TP53 làm các tế bào ung thư dễ dàng xuất
hiện và phát triển. Nghiên cứu đột biến gen TP53 và sự biểu lộ protein p53 đột
biến trong mô ung thư da sẽ góp phần tìm hiểu cơ chế gây ung thư và giúp các
nhà lâm sàng tìm ra được phương pháp điều trị bổ trợ thích hợp.
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về ung thư da, nhưng
chưa có công trình nào đi sâu về cơ chế phân tử trong ung thư da. Vì vậy đề tài
“Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thƣ da và mối liên
quan của nó với các thể bệnh” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ đột biến gen TP53 và gen BRAF trong mô các thể ung thư
da.
2. Khảo sát sự biểu lộ protein p53, protein BRAF và mối liên quan với các
gen đột biến tương ứng trong mô ung thư da.
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁC THỂ LÂM SÀNG UNG THƢ DA
1.1.1. Cấu trúc da
Da chiếm diện tích trên cơ thể khoảng 2m
2
, với tổng trọng lượng 15-
20% trọng lượng cơ thể. Da là hàng rào bảo vệ cơ thể, giúp cơ thể ổn định
thân nhiệt, chống mất nước, bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân độc hại của môi
trường như vi khuẩn, bụi bẩn, ánh nắng…trong đó quan trọng nhất là bảo vệ
cơ thể trước các tác nhân tác động của môi trường bên ngoài [6].
Hình 1.1. Cấu trúc mô học của da [6]
Da bao gồm các lớp thượng bì, trung bì và hạ bì. Thượng bì là biểu mô
lát tầng sừng hóa có nguồn gốc từ ngoại bì phôi thai, trong lớp này không có
mạch máu nuôi dưỡng.
1.1.1.1. Thượng bì
Các tế bào tạo sừng (keratinocyte) là thành phần chủ yếu tạo nên
thượng bì da. Căn cứ vào quá trình biến đổi của các tế bào tạo sừng từ trong
ra ngoài, thượng bì da được chia thành 5 lớp:
4
* Lớp đáy: Được tạo bởi một hàng tế bào khối vuông hoặc trụ nằm trên
màng đáy, chúng có khả năng sinh sản mạnh, các tế bào mới di chuyển lên
các lớp phía trên làm biểu bì luôn được đổi mới.
* Lớp vảy (lớp sợi hay lớp Malpighi): Lớp vảy có từ 5-20 hàng tế bào
lớn hình đa diện. Giữa các tế bào này có các cầu nối bào tương, ở mức siêu
hiển vi, các cầu nối thực chất là những chồi bào tương của các tế bào nằm
cạnh nhau được liên kết với nhau bởi các thể liên kết làm cho tế bào có hình
vảy hay có sợi nối với nhau.
* Lớp hạt: Có từ 3-5 hàng tế bào đa diện dẹt, trong bào tương của các
tế bào này chứa nhiều hạt bắt màu kiềm đậm, đó là những hạt keratohyalin.
Những hạt này thuộc nhóm protein sợi có liên quan đến hiện tượng sừng hóa
của biểu bì.
* Lớp bóng: Thường khó quan sát, đó là một lớp mỏng như một đường
đồng nhất, sáng. Các tế bào của lớp này dính chặt chẽ, rất mỏng, là những tế
bào chết, tất cả các bào quan và nhân đều không còn.
* Lớp sừng: Các tế bào biến thành các lá sừng mỏng, không nhân,
trong bào tương có chứa nhiều keratin, tùy từng vùng có thể có chiều dày
khác nhau.
Lớp thượng bì có nhiệm vụ bảo vệ cơ thể trước những tác động của
môi trường ngoài như các tia tử ngoại, các tác động cơ học, ngăn không cho
dịch của cơ thể thoát ra ngoài và nước từ môi trường ngoài thấm vào cơ thể.
Lớp này còn có khả năng tổng hợp và giải phóng một số cytokin như IL1,
IL6, TNFα…
1.1.1.2. Trung bì
Là một mô liên kết xơ vững chắc có chiều dày thay đổi tùy từng vùng
và được phân cách với biểu bì bởi màng đáy, trung bì được chia thành 2 lớp:
5
* Lớp nhú: Mặt ngoài của trung bì tiếp xúc với thượng bì có những chỗ
lồi lõm, chỗ lõm về phía thượng bì tạo thành các nhú trung bì. Lớp nhú có
nhiều ở những vùng phải chịu áp lực và cọ sát mạnh.
* Lớp dưới: Phần chính của trung bì nằm ở phía dưới được tạo bởi mô
liên kết đặc hơn, các sợi tạo keo tạo thành bó, đa số có hướng song song với
mặt da.
1.1.1.3. Hạ bì
Là mô liên kết thưa, lỏng lẻo nối da với cơ quan bên dưới giúp da trượt
được trên các cấu trúc nằm ở dưới. Tùy vùng cơ thể, tùy mức độ nuôi dưỡng
mà có thể tạo thành những thùy mỡ hoặc lớp mỡ dày hay mỏng. Ngoài ra da
còn có các thành phần phụ như: tuyến mồ hôi, tuyến bã, nang lông…
1.1.2. Dịch tễ ung thư da
Ung thư da là một trong những ung thư thường gặp nhất ở Mỹ. Nghiên
cứu của Stern R. S. và cs năm 2007 ở Mỹ cho thấy tỷ lệ mắc ung thư da cao
gấp 5 lần ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến [7]. Theo Miller D. L. và cs, số
bệnh nhân mắc ung thư da ngày một tăng, năm 2002 ước tính có 1,3 triệu
người Mỹ mắc ung thư da, trong đó có 53.000 người mắc ung thư tế bào hắc
tố và hơn 7.000 người chết vì loại ung thư này [8]. Năm 2006 ước tính có
khoảng trên 3,5 triệu bệnh nhân cao gấp gần 3 lần số bệnh nhân năm 2002 [7].
Ở Úc, nghiên cứu của Marks và cs cho thấy ung thư da cao gấp 3 lần
tổng số các ung thư khác cộng lại và khoảng 1% dân số bị ung thư da [9].
Trong thời gian 5 năm, ung thư tế bào vảy tăng 50% với tỷ lệ mới mắc từ
166/100.000 dân lên 250/100.000 dân trong nghiên cứu của Gilison và cs
[10].
Ở Châu Âu, tỷ lệ ung thư da cũng rất cao, theo nghiên cứu của Bulliard
J. L. và cs ở Thụy sỹ mỗi năm có 15.000 bệnh nhân mới mắc ung thư da [11].
6
Ở Anh, theo nghiên cứu của Muller H. và cs, tỷ lệ mắc ung thư da năm 2010
tăng 33% so với năm 2001 [12]. Do thói quen phơi nắng để có nước da rám
nắng cũng như sự tăng cường du lịch đến các nước nhiệt đới về mùa hè của
những người da trắng là các yếu tố quan trọng làm gia tăng ung thư da ở
người châu Âu.
Người châu Á có tỷ lệ ung thư da thấp hơn người châu Âu, theo nghiên
cứu của Sung J. và cs ở Singapore năm 2006 tỷ lệ ung thư da là 7,4/100.000
dân. Tỷ lệ ung thư biểu mô tế bào đáy ở người Trung Quốc là 18,9/100.000
dân, Người Mã lai là 6/100.000 và người Ấn Độ là 4,1/100.000 dân [13].
Ở Việt Nam, ước tính hàng năm có khoảng 8.000 trường hợp mắc ung
thư da, trong đó ung thư tế bào đáy là 80%, ung thư tế bào vảy là 15%, ung
thư tế bào hắc tố là 4%, còn lại là các ung thư khác ở da [2].
1.1.3. Yếu tố nguy cơ của ung thư da
1.1.3.1. Ánh sáng mặt trời
Ánh sáng mặt trời là nguyên nhân chính gây ung thư da, tia cực tím
trong ánh sáng mặt trời gây ung thư da theo 3 cơ chế [14]:
- Tác động trực tiếp lên DNA.
- Tạo ra các phân tử oxy hóa làm biến đổi DNA và cấu trúc các tế bào.
- Ức chế miễn dịch bẩm sinh chống ung thư của cơ thể.
Yếu tố địa dư cũng có mối liên quan chặt chẽ với tỷ lệ ung thư da,
những vùng gần đường xích đạo có tỷ lệ ung thư da cao hơn nhiều so với
những vùng khác. Theo nghiên cứu của Stone và CS cho thấy tỷ lệ ung thư tế
bào đáy ở Hawai cao gấp 4 lần so với vùng đất liền ở Mỹ [15].
Các nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng ung thư da cho thấy gần 80%
ung thư da xuất hiện ở vùng đầu, mặt, cổ, cánh tay và mu tay [12],[16],[17],
đây là những vùng da tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời.
7
1.1.3.2. Asen
Vai trò của asen gây ung thư da ở người còn chưa rõ, tuy nhiên các
nghiên cứu trên súc vật cho thấy asen có khả năng gây bệnh. Một số tác giả
cho rằng asen là tác nhân điều biến các con đường tín hiệu tế bào, làm biến
đổi các yếu tố tăng trưởng và biến đổi quá trình tăng sinh, oxy hóa, biệt hóa tế
bào và chết tế bào theo chương trình. Hơn nữa asen có thể làm tăng nguy cơ
ung thư bằng cách kích thích khối u phát triển, hoạt hóa các hormon [18]. Hậu
quả của nhiễm asen dẫn đến rối loạn chức năng của gen TP53 và phối hợp với
tia UV để tạo thành yếu tố gây ung thư. Theo các tác giả này khi có sự tương
tác giữa ánh sáng mặt trời với nhiễm asen mãn tính sẽ làm cho ung thư da
phát triển mạnh lên rất nhiều [19].
1.1.3.3. Bức xạ ion hóa
Bức xạ ion hóa có khả năng gây ung thư đã được ghi nhận từ những
năm đầu thể kỉ XX khi ung thư da thường xuất hiện ở tay các bác sĩ và kỹ
thuật viên có tiếp xúc với tia X. Các nghiên cứu dịch tễ học đã xác định xạ trị
cũng làm tăng nguy cơ phát triển ung thư da đặc biệt là ung thư tế bào đáy, xạ
trị trứng cá làm tăng nguy cơ ung thư tế bào đáy gấp 3 lần và xạ trị nấm da
đầu ở trẻ em cũng làm tăng nguy cơ ung thư tế bào đáy từ 4 - 6 lần [19].
1.1.3.4. Yếu tố cá thể
- Chủng tộc:
Các chủng tộc người khác nhau có sự lắng đọng melanin trong da khác
nhau. Đối với người da trắng, melanin chủ yếu tập trung ở lớp đáy của biểu
bì, ở các chủng tộc da màu ngoài tập trung ở lớp đáy melanin, có thể thấy ở cả
các lớp trên của thượng bì. Ung thư da có thể gặp ở cả người da trắng và da
đen, nhưng tỷ lệ cao hơn ở người da trắng [20],[21],[22]. Một nghiên cứu đa
trung tâm ở miền nam châu Âu cho thấy những người có da dễ bị bỏng nắng