Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

32 Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo một phức chất có màu, cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan, vì thế có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1μg/ml. 2.2.8.2. Hóa chất Dung dịch albumin 0.1%: 0.1g albumin pha nước cất thành 100ml dung dịch. Dung dịch A: 2g Na 2 CO 3 hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml dung dịch. Dung dịch B: cân 0.5g CuSO 4 hòa tan trong dung dịch citrat natri 1% thành 100ml dung dịch. Dung dịch C: chỉ pha để dùng ngay trong ngày gồm hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỷ lệ 49/1. 2.2.8.3. Cách tiến hành Hút 0.4ml dung dịch có chứa protein cho vào ống nghiệm sạch khô, thêm 2ml dung dịch C, lắc đều và để yên ở nhiệt độ thường trong 10 phút. Sau đó thêm 0.2ml thuốc thử Folin vào, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, đem đo mật độ quang ở bước sóng 520nm. 2.2.8.4. Cách tính * Dựng đường chuẩn Thực hiện xây dựng đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thông thường dùng albumin tinh khiết. Hút 0.4ml dung dịch albumin chuẩn có nồng độ theo thứ tự: 0; 50; 100; 150; 200; 250 μg/ml vào các ống nghiệm sạch khô đã đánh số phân biệt. Thực hiện phản ứng tương tự như trên. Muốn vậy phải thực hiện theo bảng sau để có được các dung dịch albumin chuẩn với nồng độ khác nhau: Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ protein (μg/ml) 0 50 100 150 200 250 Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Nước cất (ml) 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5

33 Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ở bước sóng 750nm (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml). * Tính kết quả Từ đồ thị chuẩn, trên cơ sở giá trị mật độ quang (trục tung) đo được của mẫu thí nghiệm có chứa protein cần xác định, ta suy ra hàm lượng protein của mẫu cần đo. 2.2.9. Xác định hoạt độ riêng của các chế phẩm enzyme [9] Hoạt độ của chế phẩm enzyme được xác định theo công thức: CPE CPE UI HđC / g HđR mg_ protein _ E / g mg_ protein _ E = = ∑ Với: + HđR: hoạt độ riêng. + HđC: hoạt độ chung. + ∑ĐVHđ: Số đơn vị hoạt độ enzyme/g CPE hay /ml CPE (∑UI/g hay ∑UI/ml). + C: mg protein/ml dung dịch enzyme hay /g CPE. + CPE: chế phẩm enzyme + UI: đơn vị hoạt độ enzyme. + ∑ UI: tổng đơn vị hoạt độ enzyme. 2.2.10. Lựa chọn phương pháp cố định γ-amylase [9][19] 2.2.10.1. Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị * Nguyên tắc Dựa vào liên kết cộng hóa trị được hình thành giữa γ-amylase lên màng chitosan.

34 * Cách tiến hành Dung dịch chitosan được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1g chitosan trong 100ml acid acetic 1%. Sau đó đổ dung dịch chitosan 1% lên phiến kính phẳng và để khô trong trong không khí trong tủ hút. Màng chitosan được ngâm trong dung dịch NaOH 0.1M/24h để trung hòa lượng acid dư. Sau đó màng được rửa nhiều lần với nước cất cho đến khi nước rửa trung tính và để khô ở nhiệt độ phòng. Màng chitosan chuẩn có bề dày khoảng 50μm. 1g chitosan tạo được 250m 2 màng. * Hoạt hóa màng chitosan Màng chitosan được ngâm và lắc trong dung dịch glutaraldehyde 2%/4h ở nhiệt độ phòng, rửa mẫu nhiều lần với nước cất nhằm loại hết dư lượng glutaraldehyde. * Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị Màng chitosan đã được hoạt hóa bằng glutaraldehyde được ngâm và lắc với 50ml dung dịch đệm chứa 0.2g chế phẩm γ-amylase/1-5h ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục dùng dung dịch đệm (với thể tích xác định) rửa màng chitosan đã có enzyme cố định để loại bỏ các enzyme không gắn kết lên màng. Lượng protein cố định và hoạt tính γ-amylase được xác định gián tiếp qua lượng protein và tổng đơn vị hoạt độ E hiện diện trong nước rửa. 2.2.10.2. Cố định γ-amylase lên chất mang là Celite (Diatomite) bằng phương pháp hấp phụ [14] * Nguyên tắc Dựa vào khả năng hấp phụ γ-amylase lên chất mang Celite. * Cách tiến hành - Cân 0.2g enzyme pha thành 50ml với dung dịch hệ đệm pH 5. - Cân 5g diatomite, cho từ từ vào 50ml dung dịch enzyme trên, khuấy hỗn hợp trong 30 phút ở 4 0 C, lọc dịch lọc bằng giấy lọc. - D ịch sau khi l enzyme trên giấy lọc được bảo quản ở nhiệt độ lạnh.

35 * Cách tính hiệu suất gắn protein: HS cố định protein (%) = (Hàm lượng Pr cố định = HL Pr trước khi cố định – HL Pr còn trong dịch lọc ) Với: + HS: hiệu suất. + HL: hàm lượng. + Pr : protein. * Cách tính hiệu suất hoạt độ enzyme γ-amylase cố định: HS hoạt độ E cố định (%) = x100% 2.2.11. Phương pháp sử dụng γ-amylase cđ từ Asp. niger và thương mại để thủy phân các loại tinh bột [12][15] * Nguyên tắc Chế phẩm γ-amylase cố định trên chất mang phù hợp ở trên sẽ được dùng thủy phân tinh bột sắn và tinh bột bắp ở nhiệt độ 45 0 C và pH=5 với độ biến thiên thời gian là 30 phút. Khả năng thủy phân dựa vào lượng đường khử tạo thành. * Cách tiến hành Cho 20ml dung dịch cơ chất 2% vào erlen 100ml, thêm vào 20ml dung dịch đệm pH 5, rồi bổ sung lượng enzyme cố định, để trên bồn ổn nhiệt và giữ ổn định ở nhiệt độ 45 0 C để thực hiện phản ứng thủy phân của γ-amylase trên cơ chất. Cứ mỗi 30 phút lấy ra 1ml đem xác định lượng đường khử tạo thành, từ đó xác định được thời gian phù hợp để có lượng đường tối đa. 2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng tái sử dụng của CPE γ-amylase cđ * Nguyên tắc HL Pr cố định HL Pr trước khi cố định x 100 ƩUI ban đầu – ƩUI còn lại trong dung di󰈨ch ƩUI ban đầu

36 Quá trình thủy phân tinh bột bởi E cđ được lặp lại nhiều lần trong bình chiết để hạn chế sự hao tổn E cđ . Kết quả mỗi lần lặp lại được xác định qua lượng đường khử tạo thành. * Cách tính Từ kết quả thu được ở các lần tái sử dụng đem so sánh với kết quả ban đầu có thể suy ra được số lần tái sử dụng của enzyme cố định. 2.2.13. Ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh khối nấm men [6], [9], [12] 2.2.13.1. Thu nhận và định lượng glucose tạo thành trong dung dịch sau thủy phân tinh bột Từ kết quả thu được theo phương pháp 2.2.10 ta xác định được nồng độ α – glucose của dung dịch sau thủy phân tinh bột bằng γ-amylase cđ . 2.2.13.2. Lên men thu sinh khối giàu protein Lấy dung dịch glucose tạo thành sau thủy phân tinh bột bằng γ-amylase cđ điều chỉnh nồng độ đường và bổ sung cao nấm men, thanh trùng để làm nguyên liệu cho quá trình nuôi nấm men bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae thương phẩm trong điều kiện hiếu khí, t o = 25 – 35 o C, pH = 3.5 để thu sinh khối giàu protein. Khi lượng sinh khối đạt 25 – 50g/l, ly tâm thu được bột nhão có 15 – 20% chất khô, sấy khô đến độ ẩm 7% và nghiền bột để thu chế phẩm sinh khối giàu protein thô. Nếu muốn thu protein ta cần phá tế bào, chiết thu dung dịch và kết tủa thu protein. Với mục đích xác định điều kiện tối ưu để đạt lượng sinh khối tối đa chúng tôi tiến hành khảo sát thêm: - Nồng độ đường phù hợp từ 4-12% (sau bổ sung đường). - Thời gian nuôi từ 2 – 6 ngày. - Nhiệt độ nuôi: 30-35 0 C.

37 2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm [12] Sử dụng cách tính xác suất thống kê để xử lý các số liệu thực nghiệm thu được. 2.2.14.1. Xác định giá trị trung bình Giá trị trung bình của các số liệu là tổng giá trị thực của mỗi lần đo chia cho số lần đo. n i X .x n = ∑ Với: + x : giá trị trung bình. + i x : giá trị của một lần đo. + n : số lần đo Nếu đo lặp lại nhiều lần trên một mẫu thí nghiệm thì ta có thể tiệm cận đến một giá trị trung bình thật, nhưng thực tế không dễ đạt được điều này. Vì vậy, để giá trị trung bình của các lần đo như là một giá trị gần đúng với giá trị trung bình thật, cần dùng phương pháp phân tích thống kê để đánh giá mức độ chính xác của các lần đo. 2.2.14.2. Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn * Độ lệch mẫu: Độ lệch mẫu là sự khác biệt giữa giá trị của một lần đo với giá trị trung bình. i ax x= − Với: + a : độ lệch mẫu. + x : giá trị trung bình. + i x : giá trị của một lần đo. * Độ lệch chuẩn: Độ lệch chuẩn là sự sai số có thể có trong một lần thu thập số liệu với n lần đo. 2 i (x x) S n1 − = − ∑

38 2.2.15. Phương pháp xây dựng đường chuẩn và hệ số góc a dựa trên phần mềm excel [4] Phương pháp này nhằm ứng dụng phần mềm Microsoft Excel để vẽ đường chuẩn và xác định nồng độ protein “C” của dung dịch protein cho tất cả các thí nghiệm, dùng các giá trị ∆OD và ứng dụng hàm Linest (∆OD, nồng độ) có sẵn trong Excel để xác định hệ số góc “a”, từ đó xác định giá trị OD đường chuẩn theo công thức: OD C a ∆ =

Phaàn 3 Keát quaû – Bieän luaän

39 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Bảo quản giống và định danh nấm mốc Asp. niger Chúng tôi nhận chủng giống có kí hiệu AN2 do phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp. Để thuận tiện cho các nghiên cứu phục vụ đề tài, sau khi hoạt hóa giống, chúng tôi gửi mẫu tới phòng xét nghiệm NK – Biotek để định danh bằng sinh học phân tử đến loài. Sau đó, chúng tôi tiến hành bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng PGA trong tủ lạnh 4 0 C theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.1. Kết quả giải trình tự 28S rRNA được tra cứu trên BLAST SEARCH cho thấy chủng AN2 thuộc loài Aspergillus niger (phụ lục 5.5) 3.2. Kết quả quan sát đại thể và vi thể chủng giống Asp. niger Tiến hành theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.2. Sau 4 ngày nuôi trên môi trường Czapek Dox cải tiến tạo được một khuẩn lạc có đường kính 46mm. Kết quả được thể hiện trong các hình 3.1; 3.2; 3.3; 3.4. Hình 3.4: Hệ bào tử đính của Asp. niger A: Bào tử đính; B: Bộ cuống đính bào tử; C: Sợi cuống Hình 3.3: Khuẩn ty của Asp. niger Hình 3.1: Mặt trước của khuẩn lạc Asp. niger Hình 3.2: Mặt sau của khuẩn lạc Asp. niger Mặt trước khuẩn lạc tròn, nhung mịn, bột rời, màu đen, viền mép màu trắng, không có giọt tiết và sắc tố. Mặt sau có màu vàng nhạt. Có những nếp nhăn hướng tâm, tiết sắc tố màu vàng cam nhạt vào môi trường. Sợi nấm có vách ngăn, đa nhân, phân nhánh, không màu. Cuống sinh bào tử không phân nhánh, khối bào tử trần. Bào tử hình cầu, nhẵn, mịn. B A A: Sợi nấm; B: Vách ngăn ngang A B C

40 Nhận xét: Từ các quan sát đại thể và vi thể khẳng định chủng tuyển chọn từ trường Đại học Khoa học Tự nhiên là chủng Asp. niger. 3.3. Định lượng mật độ bào tử trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Tiến hành theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.3. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.1 và đồ thị 3.1. Bảng 3.1 : Tương quan giữa mật độ bào tử và mật độ quang OD OD610nm Mật độ tế bào 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 N (tế bào / ml) 737,5 x 10 4 887,5 x 10 4 1338 x 10 4 2250 x 10 4 2975 x 10 4 log (N) 6,87 6,95 7,13 7,35 7,47 Đồ thị 3.1: Tương quan tuyến tính giữa mật độ bào tử và OD Nhận xét: Trong giai đoạn đầu của sự phát triển nấm mốc có sự tương quan tuyến tính giữa mật độ bào tử và mật độ quang OD. Từ đó chọn mật độ bào tử phù hợp để thu sinh khối tế bào cao và hoạt độ E cao. 3.4. Xác định hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo phương pháp so màu DNS 3.4.1. Hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo sự thay đổi thành phần môi trường Enzyme γ- amylase sinh tổng hợp bởi nấm mốc Asp. niger là E cảm ứng với nguồn cơ chất tinh bột. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh OD610nm Log (N/ml)