Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

Phaàn 1 Toång quan taøi lieäu

4 PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm giống mốc Aspergillus và Asp. niger Từ lâu nấm mốc Aspergillus đã được dùng phổ biến trong sản xuất tương, chao, nước chấm,…hay được dùng để đường hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột trong sản xuất rượu, sản xuất sinh khối,… Trong đó, một số nấm mốc đường hóa thường dùng như: Asp. oryzae, Asp. niger, Asp. awamori, Asp. usamii,… Giống mốc Aspergillus có hệ sợi nấm không màu hoặc vàng nhạt. Sợi nấm phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào. Tế bào có hạch nhân. Cuống đính bào tử không phân nhánh dài và thẳng, đầu có cuống nhỏ. Tất cả cuống nhỏ có hình chai, khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống. Những chuỗi đính bào tử xếp đối xứng tỏa tròn trên chóp nang giống đóa hoa cúc. 1.1.1. Vị trí phân loại Asp. niger [7] Giới: Eumycophyta (Nấm) – Ngành: Ascomycota – Lớp: Eurotiomycetes – Bộ: Eurotiales – Họ: Eurotia – Chi: Aspergillus – Loài: Aspergillu s niger 1.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Asp. niger [12] 1.1.2.1. Đặc tính sinh học của Asp. niger [12] Asp. niger thường gọi là mốc đen. Sợi nấm đa bào có vách ngăn, phân nhánh, không màu, một số trường hợp trở nên nâu hay sẫm màu. Cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu 20-30 µm, màu nâu đen. Thể bình gồm 2 lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai. Thể bình mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn, các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Trên môi trường nuôi cấy thích hợp, Asp. niger cho khuẩn lạc với vô số bào tử đính màu trắng, khi trưởng thành chuyển sang màu đen. Bào tử có hình cầu, kích thước khoảng 4,0-5,0μm, xù xì không đều với những gờ rõ. Mặt trái khuẩn lạc màu vàng nhạt, khi trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt thạch.

5 Nấm mốc Aspergillus nói chung và Asp. nige r nói riêng có mặt khắp nơi trong tự nhiên do có khả năng phân giải nhiều nguồn cơ chất khác nhau nhờ hệ enzyme phong phú như amylase, invertase, pectinase, maltase, gluco-oxydase,… 1.1.2.1. Đặc tính dinh dưỡng của Asp. niger [12] * Nguồn carbon A.niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường monosaccharide, disaccharide như glucose, fructose, maltose, sucrose, hay polysaccharide như tinh bột,... * Nguồn nitrogen Khi sử dụng nguồn nitrogen từ NaNO 3 và NH 4 NO 3 để bổ sung vào môi trường nuôi cấy bán rắn thì hoạt tính γ-amylase của nấm mốc cũng tăng đáng kể. * Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của A.niger. Chúng sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6-8 0 C và tối đa là 45-47 0 C, tối ưu ở 28-35 0 C. * Độ pH Khoảng pH mà A.niger sinh trưởng tốt là ở môi trường hơi acid pH= 3,5- 5,5. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Aspergillus sp. tổng hợp amylase cao nhất ở pH môi trường từ 4,8 – 5,0. * Chất cảm ứng Trong các môi trường nuôi cấy Asp. niger sinh tổng hợp amylase, người ta đều bổ sung thêm cơ chất chứa nguồn cacbon như tinh bột, dextrin, maltose nhằm kích thích khả năng sinh amylase của nấm mốc. * Ngoài ra, cần bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy nấm mốc một số chất vô cơ khác như MnSO 4 0.05%, KH 2 PO 4 1%, KCl 0.05% và độ ẩm môi trường khoảng 50-55% là thích hợp nhất cho mốc phát triển tốt.

6 1.1.2. Ứng dụng của nấm mốc Asp. niger [18] Từ lâu, con người đã biết sử dụng A.niger để sản xuất acid hữu cơ. Đặc biệt Asp. niger có khả năng tổng hợp acid citric rất mạnh, lượng acid citric sử dụng trên thị trường hiện nay được sản xuất bằng phương pháp lên men tới 90%. Ngoài ra, Aspergillus niger là chủng nấm mốc được sử dụng khá phổ biến trong công nghệ sản xuất E. Tùy điều kiện nuôi cấy mà chủng nấm mốc này có thể sinh ra các loại E như: amylase, invertase, maltase, protease, pectinase và cellulase,… Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học để sản xuất phụ gia thực phẩm, các enzyme dùng trong công nghiệp và dược phẩm, cũng như có tiềm năng ứng dụng phân hủy sinh học. 1.2. Đặc điểm nấm men Sac. cerevisiae [14] 1.2.1. Đặc điểm nấm men Nấm men luôn được xem là một trong những nhóm vi sinh vật gần gũi với con người. Tế bào nấm men rất giàu protein – được coi là nguồn protein đơn bào rất quý giá, là nguồn dinh dưỡng gián tiếp qua chăn nuôi tới con người. Ngoài ra, các sản phẩm lên men từ nấm men như rượu, bia và các dạng đồ uống có cồn khác cũng rất được ưa chuộng. 1.2.1.1. Vị trí phân loại Sac. cerevisiae [14] Giới: Eumycophyta (Nấm) – Ngành: Ascomycota – Lớp: Ascomycetes – Bộ: Endomycetes – Họ: Saccharomycetaceae – Chi: Saccharomyces – Loài: Saccharomyces cerevisiae. 1.2.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Sac. cerevisiae [14] [20] Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, hô hấp tùy tiện, sinh sản bằng cách nảy chồi, dị dưỡng bằng các hydratcarbon, trước hết là đường. Kích thước tế bào nấm men khoảng 8 - 15 μm, có hình thái đa dạng và cấu tạo gồm: vỏ (hoặc thành), màng, tế bào chất, nhân, một hoặc 2 không bào và những giọt

7 mỡ, hạt glycogen. Ở một số nấm men, vỏ tế bào có khả năng kết dính giúp gắn kết các tế bào với nhau, có ý nghĩa lớn trong sản xuất cồn vì thuận tiện cho quá trình lọc dịch lên men và thu hồi chủng giống để tái sử dụng. Trong giống Saccharomyses, quan trọng nhất là loài Sac. cerevisiae được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Thành phần chất khô của tế bào nấm men có nhiều chất dinh dưỡng có giá trị như: protein và các chất có nitơ khác chiếm 50% , chất béo 1,6%, hydratcarbon 33,2%, mô tế bào 7,6%, tro 7,6%. Nấm men được chú ý nhiều, vì không những trong tế bào của chúng có nhiều chất dinh dưỡng có giá trị mà chúng còn có khả năng tăng sinh khối và các đặc điểm sinh lý phù hợp với điều kiện sản xuất công nghiệp [14] Trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối, ngoài glucid từ 5-7% và chất khoáng thường có đủ sẵn trong môi trường cũng cần bổ sung thêm nguồn Nitơ từ ure hay amonsunfat với lượng từ 0.15-0.2g/lít canh trường. Nếu thiếu nitơ nấm men sẽ phát triển chậm, thời gian lên men kéo dài, hiệu suất lên men giảm. Ngoài ra, có thể bổ sung thêm nguồn phospho là diamonphosphate, nguồn K từ KCl, nguồn Mg – MgSO 4 , nguồn chất sinh trưởng như cao ngô, cao nấm men,…Các thành phần môi trường được hòa tan, lọc bỏ cặn, điều chỉnh pH tới 4,8 – 5,2 bằng HCl hay H 2 SO 4 [14] 1.2.2. Các ứng dụng của nấm men Sac. cerevisiae [14] Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền trong lĩnh vực nghiên cứu nấm men đã tạo ra nhiều chủng, giống mới mang đặc tính ưu việt như: tuyển chọn các chủng nấm men bia có khả năng kết lắng cao, tạo chủng nấm men mới có hoạt tính phân giải β-glucan cao, hay tạo một chủng nấm men có hoạt tính cellulase cao nhờ việc chuyển một gene cellulase từ Trichoderma recset vào Saccaromyces,…Từ đó, những chủng nấm men mới với những đặc tính ưu việt này được ứng dụng hiệu quả vào ngành công nghệ thực phẩm. 1.3. Sơ lược về enzyme và γ-amylase 1.3.1. Giới thiệu về enzyme

8 1.3.1.1.Khái niệm chung về E[11][2] E là chất xúc tác sinh học có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu cơ chất rất cao, có bản chất là protein. Sự có mặt của E trong các phản ứng hóa học sẽ làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng, làm tăng nhanh tốc độ phản ứng để đạt đến cân bằng phản ứng. 1.3.1.2. Nguồn nguyên liệu thu nhận E E có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau a/ Nguồn động vật [11] Đây là nguồn E được phát hiện và thu nhận sớm nhất. Người ta đã thu nhận từ tụy tạng, màng nhầy dạ dày heo, dạ dày bê, gan, mật,…nhiều loại E như: trypsin, pepsin, rennin, ribonuclease, amylase,… b/ Nguồn gốc thực vật [11] Một số loại E được thu nhận từ thực vật như: Urease từ cây đậu rựa (Canavalin ensifirmis), bromelin từ cây họ dứa (Bromalaceae), papain từ nhựa đu đủ (Carica Papaya. L), hệ E β-amylase từ hạt ngũ cốc và một số loại củ chứa tinh bột nảy mầm. c/ Nguồn vi sinh vật [17] Đây là nguồn E phong phú nhất, có ở hầu hết các loài vi sinh vật như: nấm mốc, vi khuẩn, và một số loại nấm men. Người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại E nhất định cần thiết nào đó. So với việc thu nhận E từ các nguồn động vật, thực vật thì vi sinh vật vẫn là nguồn thích hợp nhất để sản xuất E ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống vì những lợi ích chính sau: - Chủ động về nguồn giống và nguyên liệu nuôi cấy. - Có chu kỳ sinh trưởng ngắn nên có thể thu hoạch nhiều lần quanh năm.

9 - Có thể chủ động điều khiển sinh tổng hợp E dễ dàng theo định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi. - Hiệu quả kinh tế cao hơn. 1.3.1.3. Phương pháp thu nhận E [17] Các chế phẩm E được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết. Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa E được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất như rượu, nước chấm,…Với những nghiên cứu khoa học, y học,… lại cần sử dụng chế phẩm E tinh khiết để xác định khối lượng phân tử, cấu trúc E và chữa bệnh. a/ Thu dịch E [17] Đối với các loại E nội bào, phải nghiền nát tế bào bằng nhiều cách như nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, tạo áp suất thẩm thấu cao từ muối, dung môi hữu cơ,…hay kết tủa E bằng các chất điện ly thích hợp. Đối với trường hợp E ngoại bào, có thể tách sinh khối và cặn bã khỏi canh trường bằng cách lọc li tâm, lọc ép có sử dụng tác nhân trợ kết tủa,… b/ Thu nhận chế phẩm E thô [11] [17] Chế phẩm E thô là chế phẩm E chưa được tinh chế có nồng độ chất khô thấp 4- 6g/l, có thể chứa một vài loại E chủ yếu, một số loại protein không phải E, các chất ổn định và các tạp chất khác. Sau khi thu dịch E từ canh trường nuôi cấy, bước đầu cô đặc chân không ở nhiệt độ 40-45 0 C để đạt nồng độ chất khô 30-35g/l. Tiếp theo bổ sung thêm chất bảo quản như NaCl, glycerin, benzoat,…rồi sấy phun ở 120 0 C sẽ thu được chế phẩm E dạng bột. Cũng có thể kết tủa E từ dung dịch sau cô đặc bằng các dung môi thích hợp như aceton, ethanol, …Sau khi li tâm tách kết tủa có thể trộn thêm các chất ổn định rồi sấy khô và nghiền mịn để thu được chế phẩm dạng bột. c/ Thu chế phẩm E tinh khiết [11] [17]

10 E tinh khiết có hoạt độ chung và hoạt độ riêng cao hơn nhiều so với chế phẩm ban đầu, nhưng quy trình làm sạch rất phức tạp, công phu và tốn kém. Việc tinh chế E có thể tiến hành bằng nhiều phương pháp qua nhiều giai đoạn: - Hòa tan chế phẩm E thô vào nước hay dung dịch muối,…kết tủa trở lại bằng ethanol, aceton hay (NH 4 ) 2 SO 4 rồi dùng phương pháp thẩm tích, thẩm thấu ngược hay lọc gel để loại các muối vô cơ. - Tách E bằng phương pháp hấp phụ chọn lọc: cho dịch E chảy từ từ qua cột chất hấp phụ (thường là hydrat oxit-nhôm, silicagel), các E khác nhau sẽ được hấp phụ với khả năng khác nhau, sau đó dùng các dung dịch đệm thích hợp để chiết rút E ra khỏi cột. - Tách E bằng phương pháp trao đổi ion: dựa vào sự trao đổi ion giữa E có điện tích với các ion cùng dấu của nhựa (các dẫn xuất cellulose, …). Dùng dung dịch chất điện giải đẩy khỏi nhựa các E vừa liên kết với chúng. Như vậy, các E khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đó phần chiết chứa E cần thu với nồng độ cao nhất. 1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp E của vi sinh vật [20] Ngoài yếu tố di truyền, quá trình sinh tổng hợp E còn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố sinh trưởng như nhiệt độ, pH, thành phần dinh dưỡng, cơ chất cảm ứng,… a/ Giống vi sinh vật [20] Chủng giống vi sinh vật thuần khiết, có chất lượng tốt, đảm bảo được các yêu cầu của sản xuất phải có những đặc tính cơ bản sau: - Tạo sản phẩm chính năng suất cao, không sinh độc tố. - Khả năng thích ứng và phát triển nhanh, thời gian thu sản phẩm ngắn và dễ dàng, hiệu suất thu hoạch cao. - Luôn bảo tồn được các đặc tính di truyền quý trong quá trình sử dụng cũng như bảo quản.

11 b/ Ảnh hưởng của nhiệt độ [20] Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp E của vi sinh vật cũng như tính chất của E được tổng hợp. Nhiệt độ thích hợp cho các loại nấm mốc phát triển là 22-32 0 C, vi khuẩn là 35-45 0 C. c/ Ảnh hưởng của pH môi trường [11] pH ban đầu của môi trường thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật khác nhau sẽ không giống nhau. Đối với nấm mốc, pH thích hợp trong khoảng 3.8-5.6 còn đối với vi khuẩn là 6.2-7.4. Lưu ý trong quá trình nuôi cấy, tùy thành phần môi trường và các sản phẩm trao đổi chất trong quá trình sống của vi sinh vật mà pH môi trường có thể chuyển sang acid hay kiềm. d/ Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy [11] Đây là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sống cũng như khả năng sinh tổng hợp E của vi sinh vật. Vì vậy, khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp E mong muốn là cao nhất. Môi trường nuôi vi sinh vật cần đảm bảo chứa đủ các chất C, N, H, O và các khoáng vi lượng khác như Fe, Mn, K,… 1.3.2. Giới thiệu về γ-amylase [37][13] Hệ E amylase là một trong số các hệ E được sử dụng rộng rãi nhiều trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Hiện nay người ta biết có 3 loại E amylase, trong đó, γ-amylase ở vị trí hàng đầu về hiệu lực thủy phân tinh bột và các sản phẩm trung gian. 1.3.2.1. Cấu trúc γ-amylase [37] Có tên hệ thống α-1,4-glucan-glucohydrolase, mã số EC 3.2.1.3, còn được gọi là glucoamylase hay amyloglucosidase.

12 Hình 1.1: Cấu trúc không gian γ-amylase [38] γ-amylase gồm 2 dạng cấu trúc khác nhau là γ-amylase I (thành phần cacbonhydrat chiếm khoảng 18%) và γ-amylase II (thành phần cacbonhydrat chiếm khoảng 10%), nhưng đều là những chuỗi glyco-protein. Trong phân tử γ-amylase có chứa D-glucose, D-maltose, D-galactose giúp ổn định cấu trúc E, ngoài ra còn giúp tạo liên kết với cơ chất là các phân tử polysaccharide, từ đó tạo thuận lợi cho quá trình thủy phân. Số lượng acid amin tham gia vào chuỗi polypeptid cấu tạo nên phân tử γ-amylase thu nhận từ nấm mốc Asp. niger và Asp. awamori vào khoảng 650-700 acid amin. Trong không gian, phân tử γ-amylase được chia làm ba vùng gồm: vùng SBD (Starch binding do main-vùng gắn kết với tinh bột), vùng CD (Catalyse domain-vùng xúc tác), vùng Linker có độ dài khoảng 100Å giúp liên kết hai vùng trên lại với nhau. 1.3.2.2. Đặc tính [30] γ-amylase là E ngoại bào, thuộc nhóm exo-α-1,4 D-glucohydrolase, có khả năng phân cắt nối α-1,4 lẫn nối α-1,6 glycoside để biến đổi 100% tinh bột đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Đa số γ-amylase đều thuộc loại “chịu axit”, pH opt =3,5-5,5 t 0 opt = 50-60 0 C, mất hoạt tính ở t > 70 0 C. Hình 1.2: Quá trình thủy phân tinh bột của các enzyme amylase [39]