Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CT : Canh trường CPE : Chế phẩm enzyme CPE ht : Chế phẩm enzyme hòa tan CPE cđ : Chế phẩm enzyme cố định CPE – TM : Chế phẩm enzyme thương mại DNS : 3,5 – dinitrosalicylic axit dd : dung dịch E : Enzyme E cđ : Enzyme cố định HL : Hàm lượng HS : Hiệu suất pH opt : pH tối ưu Pr : Protein OD : Giá trị mật độ quang OD 0 : Giá trị mật độ quang mẫu đối chứng OD T : Giá trị mật độ quang mẫu thật OD TB : Giá trị mật độ quang trung bình t opt : Nhiệt độ tối ưu TN : Thí nghiệm

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Tương quan giữa mật độ quang OD và mật độ bào tử ................................. 40 Bảng 3.2: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột bắp ......................................................................................................... 41 Bảng 3.3: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột năng ....................................................................................................... 42 Bảng 3.4: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy .. 44 Bảng 3.5: Hoạt độ chung của CPE γ-amylase từ canh trường Asp. niger .................... 45 Bảng 3.6: Hiệu suất thu nhận CPE γ-amylase từ canh trường Asp. niger ................... 45 Bảng 3.7: Hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger ............................................................................................................. 46 Bảng 3.8: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan.................................................. 47 Bảng 3.9: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan .......................................................... 48 Bảng 3.10: Hoạt độ chung của CPE γ-amylase - TM .................................................. 49 Bảng 3.11: Hàm lượng Protein trong CPE γ-amylase - TM ......................................... 50 Bảng 3.12: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng CPE γ-amylase - TM dạng hòa tan .............................................................. 51 Bảng 3.13: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan ............................................................. 52 Bảng 3.14: Lượng protein CPE γ-amylase cố định và hiệu suất gắn γ-amylase lên diatomite và chitosan ................................................................................... 54 Bảng 3.15: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase cố định và hiệu suất hoạt độ γ-amylase cố định .............................................................................................................. 54 Bảng 3.16: Lượng protein CPE γ-amylase – TM cố định và hiệu suất gắn cố định protein γ-amylase lên diatomite và chitosan................................................ 55

Bảng 3.17: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase - TM cố định và hiệu suất cố định γ- amylase ........................................................................................................ 56 Bảng 3.18: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột khác nhau bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng cố định trên chất mang chitosan ........................................................................................................ 57 Bảng 3.19: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột khác nhau bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng cố định trên chất mang diatomite ...................................................................................................... 58 Bảng 3.20: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột khác nhau bằng CPE γ-amylase - TM cố định trên chất mang chitosan ..... 60 Bảng 3.21: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột khác nhau bằng CPE γ-amylase - TM cố định trên chất mang diatomite ... 62 Bảng 3.22: Hiệu suất sử dụng CPE từ Asp. niger cố định trên chitosan....................... 63 Bảng 3.23: Hiệu suất sử dụng CPE từ Asp. niger cố định trên diatomite ..................... 64 Bảng 3.24: Hiệu suất sử dụng CPE cđ _chitosan thương mại ........................................ 66 Bảng 3.25: Hiệu suất sử dụng CPE cđ _diatomite thương mại ....................................... 67 Bảng 3.26: Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp. niger và thương mại thủy phân bột năng tạo glucose .................................................................................................. 69 Bảng 3.27: Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein .................................... 70

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Cấu trúc không gian γ-amylase .................................................................... 12 Hình 1.2: Quá trình thủy phân tinh bột của các enzyme amylase ................................ 12 Hình 1.3: Cấu tạo tinh bột ............................................................................................. 21 Hình 1.4: Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi E vi sinh vật .................................... 24 Hình 1.5: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men ............................. 25 Hình 3.1: Mặt trước của khuẩn lạc Asp. niger .............................................................. 39 Hình 3.2: Mặt sau của khuẩn lạc Asp. niger ................................................................. 39 Hình 3.3: Khuẩn ty của Asp. niger ................................................................................ 39 Hình 3.4: Hệ bào tử đính của Asp. niger ....................................................................... 39

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thị 3.1: Tương quan giữa mật độ OD và mật độ bào tử .......................................... 40 Đồ thị 3.2: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan.................................................. 47 Đồ thị 3.3: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan.................................................. 48 Đồ thị 3.4: So sánh nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan và bột năng bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan ............... 49 Đồ thị 3.5: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan ............................................................. 51 Đồ thị 3.6: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan ............................................................. 52 Đồ thị 3.7: So sánh nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan và bột năng bằng CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan ........................... 53 Đồ thị 3.8: Hiệu suất sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan và trên diatomite ............................................................................................... 65 Đồ thị 3.9: Hiệu suất sử dụng CPE γ-amylase – TM cố định trên chitosan và trên diatomite ...................................................................................................... 68

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột bắp ....................................................................................................... 41 Biểu đồ 3.2: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột năng .................................................................................................... 42 Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của hai loại môi trường nuôi cấy nấm mốc Asp. niger đến hoạt độ γ-amylase ...................................................................................... 43 Biểu đồ 3.4: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy44 Biểu đồ 3.5: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột bởi CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan ............................ 57 Biểu đồ 3.6: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột bởi CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên diatomite .......................... 59 Biểu đồ 3.7: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột bằng CPE γ-amylase thương mại cố định trên chitosan ............................ 61 Biểu đồ 3.8: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột bằng CPE γ-amylase thương mại cố định trên diatomite .......................... 62 Biểu đồ 3.9: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _chitosan từ canh trường Asp. niger ........... 64 Biểu đồ 3.10: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _diatomite từ canh trường Asp. niger ....... 65 Biểu đồ 3.11: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _chitosan thương mại ................................ 66 Biểu đồ 3.12: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _diatomite thương mại .............................. 67 Biểu đồ 3.13: Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp .niger và TM thủy phân bột năng tạo glucose ....................................................................................................... 67

Môû ñaàu

1 PHẦN MỞ ĐẦU Enzyme (E) là một loại chất xúc tác sinh học, hiện nay E được sử dụng rộng rãi trong nhiều quy trình công nghệ sản xuất công nghiệp như: công nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm, sản xuất thức ăn gia súc và bảo vệ thực vật, xử lý môi trường,…Việc ứng dụng E đã trở thành một trong những chiến lược quan trọng nhất nhằm đưa ra những quy trình phản ứng hóa học thân thiện với môi trường, đồng thời giúp tiết kiệm nguyên liệu và năng lượng. E có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong đó, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều đặc tính ưu việt hơn enzyme từ động vật hay thực vật. Mặc dù E được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực vì có nhiều đặc tính ưu việt, nhưng trên thực tế sản xuất, việc sử dụng E vẫn còn những giới hạn nhất định. Bên cạnh chi phí cao cho việc tách chiết và tinh sạch E, khó khăn lớn nhất là tính kém bền vững và độ nhạy với nhiệt độ, pH,… của chúng, nên hiệu quả sử dụng không cao. Vì vậy mà E có thời gian tồn tại ngắn, chi phí cao cho việc tách E ra khỏi sản phẩm phản ứng và việc phục hồi các trung tâm hoạt động để tái sử dụng gặp nhiều khó khăn. Một trong những kỹ thuật thông dụng và hiệu quả nhất để khắc phục những mặt hạn chế trên là sự cố định E. Kỹ thuật này giúp cố định cấu trúc không gian mà không làm giảm hoạt lực của E. Từ đó tạo nhiều chế phẩm E không hòa tan có khả năng tái sử dụng nhiều lần, phục vụ cho từng mục đích sản xuất cụ thể, đặc biệt thích hợp cho các quá trình tự động hóa trong sản xuất liên tục. Nhìn chung, kỹ thuật cố định E chắc chắn đã và đang là một hướng phát triển đầy tiềm năng của ngành công nghệ E. Trong các E có nhiều ứng dụng thực tiễn của lĩnh vực công nghệ thực phẩm là hệ enzyme amylase. Đề tài của chúng tôi nhằm nghiên cứu tạo ra chế phẩm γ –

2 amylase cố định thủy phân tinh bột tạo sản phẩm là α-glucose có giá trị cao. γ – amylase có khả năng cắt các loại liên kết 1, 4 ha y 1, 6 – O – glycoside, khả năng thủy phân triệt để tạo sản phẩm cuối cùng chủ yếu là glucose và sau phản ứng có thể dễ dàng tách E ra khỏi sản phẩm. Nhìn chung, qua nhiều nghiên cứu ứng dụng các E cđ trong sản xuất ở trong và ngoài nước đó đã mở ra một câu hỏi, liệu rằng chế phẩm γ – amylase cố định có thể trở thành một trong những nguồn chế phẩm E đầy tiềm năng cho ngành công nghiệp sản xuất α – glucose từ nguyên liệu tinh bột không? Do đó, để góp phần đánh giá thêm tiềm năng ứng dụng này của enzyme cố định, chúng tôi xin được tiến hành đề tài “Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định” với các nhiệm vụ cụ thể như sau: - Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy nấm mốc Asp. niger để thu γ – amylase có hoạt tính cao. - Sử dụng một phương pháp mới trong kỹ thuật sử dụng E đó là phương pháp cố định E. - Cố định γ – amylase trên chất mang vô cơ diatomite và chất mang hữu cơ chitosan. - Xác định hoạt độ các loại enzyme:  γ - amylase hòa tan từ Asp. niger.  γ – amylase hòa tan thương mại.  γ – amylase cố định từ Asp. niger và thương mại. - Nghiên cứu sự thủy phân một số loại tinh bột của các loại enzyme hòa tan và cố định.

3 - So sánh hiệu quả sự thủy phân tinh bột bởi ba loại enzyme trên. - Chứng minh hiệu quả sử dụng E cđ qua sự tái sử dụng trong thủy phân tinh bột. - Bước đầu tạo sinh khối nấm men trên dung dịch đường sau thủy phân.