Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Hà Tú Trâm NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI γ-AMYLASE VI SINH VẬT DẠNG HÒA TAN VÀ DẠNG CỐ ĐỊNH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Hà Tú Trâm NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI γ-AMYLASE VI SINH VẬT DẠNG HÒA TAN VÀ DẠNG CỐ ĐỊNH Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PSG.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU Thành phố Hồ Chí Minh - 2012

LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng bày tỏ lời cám ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS Đồng Thị Thanh Thu, người đã khơi gợi đề tài cũng như đã tận tình hướng dẫn khoa học, luôn quan tâm và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này. Xin ghi nhớ công ơn các Thầy Cô Khoa Sinh học, các Thầy Cô Phòng Sau Đại học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức quý báu cho học viên chúng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô thuộc bộ môn Sinh hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu và các đồng nghiệp Trường THPT Chuyên Lê Hồng Phong, quận 5, Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua. Đặc biệt tôi trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Trần Ngọc Danh và Thầy Lê Văn Thanh đã luôn quan tâm, động viên và trợ giúp cho tôi trong thời gian theo học lên thạc sĩ. Xin được gửi lời cảm ơn đến các bạn Lê Hồng Phú, Phan Thị Phương Dung, Trần Quốc Tuấn, em Trương Thị Quỳnh Trâm, Trần Thị Ngọc Diệp đã cùng chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm cũng như giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến ba mẹ, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong cuộc sống. Xin được gửi lời tri ân đến những người thân yêu trong gia đình luôn hỗ trợ, động viên tôi trong học tập và nghiên cứu. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2012 Hà Tú Trâm

i MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 4 1.1. Đặc điểm giống mốc Aspergillus và Asp. niger.................................................... 4 1.1.1. Vị trí phân loại Asp. niger [7] .......................................................................... 4 1.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Asp. niger [12] ............................................ 4 1.1.2.1. Đặc tính sinh học của Asp. niger [12] ...................................................... 4 1.1.2.1. Đặc tính dinh dưỡng của Asp. niger [12] ................................................. 5 1.1.3. Ứng dụng của nấm mốc Asp. niger [18] .......................................................... 6 1.2. Đặc điểm nấm men Sac. cerevisiae [14] ............................................................... 6 1.2.1. Đặc điểm nấm men .......................................................................................... 6 1.2.1.1. Vị trí phân loại Sac. cerevisiae [14] ......................................................... 6 1.2.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Sac. cerevisiae [14] [20] ..................... 6 1.2.2. Các ứng dụng của nấm men Sac. cerevisiae [14] ............................................ 7 1.3. Sơ lược về enzyme và γ-amylase .......................................................................... 7 1.3.1. Giới thiệu về enzyme ....................................................................................... 7 1.3.1.1.Khái niệm chung về E[11][2] .................................................................... 8 1.3.1.2. Nguồn nguyên liệu thu nhận E ................................................................. 8 1.3.1.3. Phương pháp thu nhận E [17] ................................................................... 9 1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp E của vi sinh vật [20] .... 10 1.3.2. Giới thiệu về γ-amylase [37][13] ................................................................... 11 1.3.2.1. Cấu trúc γ-amylase [37] ......................................................................... 11 1.3.2.2. Đặc tính [30] ........................................................................................... 12 1.3.2.3. Nguồn nguyên liệu thu nhận [35][39] .................................................... 13 1.4. Enzyme cố định (immobilized enzyme) ............................................................. 13 1.4.1. Khái quát sự cố định E [19] ........................................................................... 13 1.4.2. Vật liệu cố định enzyme [19] ......................................................................... 13 1.4.2.1. Vật liệu vô cơ [16][5] ............................................................................. 13

ii 1.4.2.2. Vật liệu hữu cơ [19][21] ......................................................................... 13 1.4.3. Một số phương pháp chủ yếu tạo E cđ [19][22][25] ....................................... 14 1.4.3.1. Phương pháp vật lí [19][4] ..................................................................... 15 1.4.3.2. Phương pháp hóa học [19][24] ............................................................... 15 1.4.3.3. Phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel [19] ................................... 15 1.4.3.4. Phương pháp microcapsule (phương pháp tạo vi túi) [19] ..................... 16 1.4.3.5. Phương pháp siêu lọc [19] ...................................................................... 16 1.4.4. Lựa chọn phương pháp cố định ..................................................................... 17 1.4.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định E [19] ............................................ 17 1.4.5.1. Ảnh hưởng của chất mang [19] .............................................................. 17 1.4.5.2. Ảnh hưởng của pH [19] .......................................................................... 18 1.4.6. Ứng dụng E cđ và các thành tựu nghiên cứu về E cđ [23][27][28][29] ............ 18 1.4.6.1 Ứng dụng trong y học [19] ...................................................................... 18 1.4.6.2. Ứng dụng trong kỹ thuật sinh hóa [19][36] ............................................ 19 1.4.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp [19] .......................................................... 19 1.4.6.4. Ứng dụng trong bảo vệ môi trường [19] ................................................ 20 trước khi đưa ra môi trường bên ngoài. .............................................................. 20 1.5. Sự thủy phân tinh bột và ứng dụng sản phẩm sau thủy phân ........................ 20 1.5.1. Đại cương về tinh bột [31] ............................................................................. 20 1.5.2. Đặc tính tinh bột sắn và tinh bột bắp [1][10] ................................................. 22 1.5.2.1. Đặc tính tinh bột sắn [1][10] .................................................................. 22 1.5.2.2. Đặc tính tinh bột bắp [14][31] ................................................................ 22 1.5.3. Các phương pháp thủy phân tinh bột [1][10] ................................................ 23 1.5.3.1. Thủy phân tinh bột bằng acid [10][32] ................................................... 23 1.5.3.2. Thủy phân tinh bột bằng enzyme [11][33] ............................................. 23 1.5.4. Các sản phẩm thủy phân tinh bột và ứng dụng [14] ...................................... 24 PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 26 2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................................... 26 2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 26

iii 2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .................................................................... 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 26 2.2.1. Phương pháp giữ giống Asp. niger [20]......................................................... 26 2.2.2. Quan sát các đặc điểm hình thái của chủng giống Asp. niger [12][20] ......... 27 2.2.2.1. Quan sát đại thể [12][20] ........................................................................ 27 2.2.2.2. Quan sát vi thể bằng kĩ thuật làm phòng ẩm[20] ................................... 27 2.2.3. Phương pháp định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu [9][12][20] .................................................................................................................... 28 2.2.4. Phương pháp khảo sát thời gian nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy Asp. niger thu γ – amylase [8] ...................................................................................... 29 2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp γ – amylase từ Asp. niger [3][7][9] ........................................................................................................................ 30 2.2.5.1. Thời gian nuôi cấy .................................................................................. 30 2.2.5.2. Thành phần môi trường thay đổi ............................................................ 30 2.2.6. Phương pháp thu nhận γ – amylase từ Asp. niger [9][14][25] ...................... 30 2.2.7. Xác định hoạt độ γ – amylase theo phương pháp so màu với DNS [9] ......... 31 2.2.7.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 31 2.2.7.2. Cách tính ................................................................................................. 31 2.2.8. Định lượng protein hòa tan trong CPE theo phương pháp Lowry [12][26] .. 31 2.2.8.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 31 2.2.8.2. Hóa chất .................................................................................................. 32 2.2.8.3. Cách tiến hành ........................................................................................ 32 2.2.8.4. Cách tính ................................................................................................. 32 2.2.9. Xác định hoạt độ riêng của các chế phẩm enzyme [9] .................................. 33 2.2.10. Lựa chọn phương pháp cố định γ-amylase [9][19] ...................................... 33 2.2.10.1. Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị ...................................................................................................................................... 33 2.2.10.2. Cố định γ-amylase lên chất mang là Celite (Diatomite) bằng phương pháp hấp phụ [14] ......................................................................................................... 34

iv 2.2.11. Phương pháp sử dụng γ-amylase cđ từ Asp. niger và thương mại để thủy phân các loại tinh bột [12][15] ..................................................................................... 35 2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng tái sử dụng của CPE γ-amylase cđ ............ 35 2.2.13. Ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh khối nấm men [6], [9], [12] .......................................................................................................... 36 2.2.13.1. Thu nhận và định lượng glucose tạo thành trong dung dịch sau thủy phân tinh bột ................................................................................................................. 36 2.2.13.2. Lên men thu sinh khối giàu protein ...................................................... 36 2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm [12] .............................................. 37 2.2.14.1. Xác định giá trị trung bình ................................................................... 37 2.2.14.2. Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn .............................................. 37 2.2.15. Phương pháp xây dựng đường chuẩn và hệ số góc a dựa trên phần mềm excel [4] ........................................................................................................................ 38 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..................................................................... 39 3.1. Bảo quản giống và định danh nấm mốc Asp. niger .......................................... 39 3.2. Kết quả quan sát đại thể và vi thể chủng giống Asp. niger .............................. 39 3.3. Định lượng mật độ bào tử trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu ..................... 40 3.4. Xác định hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo phương pháp so màu DNS ..................................................................................................................... 40 3.4.1. Hoạt độ γ-amylase từ canh trường As p. niger theo sự thay đổi thành phần môi trường .................................................................................................................... 40 3.4.1.1. Ảnh hưởng thành phần môi trường khi cơ chất cảm ứng là bột bắp ...... 41 3.4.1.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường khi cơ chất cảm ứng là bột năng .... 42 3.4.2. Hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy ......... 43 3.5. Nuôi cấy nấm mốc theo điều kiện tối ưu tuyển chọn về thời gian và thành phần môi trường chất cảm ứng ................................................................................. 44 3.6. Thu nhận CPE γ-amylase từ môi trường Asp. niger trên môi trường bán rắn (trong điều kiện tối ưu trên) ...................................................................................... 45 3.7. Hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger ........ 45

v 3.7.1. Hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger ...................................................................................................................................... 46 3.7.2. Hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger ........ 46 3.8. Sử dụng CPE γ-amylase hòa tan từ canh trường Asp. niger để thủy phân các loại tinh bột khác nhau .............................................................................................. 46 3.9. Xác định hoạt độ riêng γ-amylase thương mại Dextrozyme theo phương pháp so màu DNS ....................................................................................................... 49 3.9.1. Xác định hoạt độ chung CPE - TM theo phương pháp so màu DNS ............ 49 3.9.2. Xác định hàm lượng protein của CPE - TM theo phương pháp Lowry ........ 50 3.9.3. Xác định hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thương mại ............................... 50 3.10. Sử dụng CPE γ-amylase thương mại Dextrozyme GA để thủy phân các loại tinh bột khác nhau ..................................................................................................... 51 3.10.1. Sử dụng CPE γ-amylase – TM để thủy phân tinh bột tan ........................... 51 3.10.2 Sử dụng CPE γ-amylase – TM để thủy phân bột năng ................................. 52 3.11. Cố định CPE γ-amylase từ Asp. niger lên chất mang là diatomite bằng phương pháp hấp phụ và lên chất mang là chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị .................................................................................................................................. 53 3.11.1. Hiệu suất gắn protein lên các chất mang ..................................................... 53 3.11.2. Hiệu suất cố định hoạt độ CPE γ-amylase ................................................... 54 3.12. Cố định CPE γ-amylase thương mại lên chất mang là diatomite bằng phương pháp hấp thụ và lên chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị ............... 55 3.12.1. Hiệu suất gắn protein lên các chất mang ..................................................... 55 3.12.2. Hiệu suất cố định hoạt độ CPE γ-amylase thương mại ............................... 56 3.13. Sử dụng CPE γ-amylase cố định để thủy phân các loại tinh bột khác nhau ...................................................................................................................................... 56 3.13.1. Sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định để thủy phân các loại tinh bột khác nhau...................................................................................................................... 56 3.13.2. Sử dụng CPE γ-amylase thương mại cố định để thủy phân các loại tinh bột khác nhau...................................................................................................................... 60

vi 3.14. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase cố định ................................ 63 3.14.1. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định ......... 63 3.14.2. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase cố định thương mại ........... 66 3.15. Kết quả ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh khối giàu protein ........................................................................................................ 68 3.15.1. Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp. niger và thương mại thủy phân bột năng tạo dung dịch đường ........................................................................................................... 68 3.15.2. Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein từ dung dịch thủy phân tinh bột.......................................................................................................................... 70 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 71 4.1. Kết luận ................................................................................................................ 71 4.1.1. Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho nấm mốc Asp.niger sinh tổng hợp enzyme γ- amylase có hoạt tính cao là: ........................................................................ 71 4.1.2. Thu nhận CPE γ-amylase từ môi trường nuôi cấy Aspergillus niger ............ 71 4.1.3. Hoạt độ CPE γ-amylase – TM ...................................................................... 71 4.1.4. Xác định nồng độ glucose tạo thành khi thủy phân một số loại tinh bột bởi CPE γ- amylase TM và từ Asp. niger hòa tan ............................................................. 72 4.1.4.1. CPE từ Asp. niger ................................................................................... 72 4.1.4.2. CPE thương mại ..................................................................................... 72 4.1.5. Hiệu suất cố định CPE γ- amylase từ Asp. niger và TM trên một số chất mang ............................................................................................................................. 72 4.1.5.1. CPE từ Asp. niger ................................................................................... 72 4.1.5.2. CPE thương mại ..................................................................................... 72 4.1.6. Xác định nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột bởi CPE γ- amylase từ Asp. niger và TM cố định trên một số chất mang ........................ 73 4.1.6.1. Thủy phân các loại tinh bột bởi CPE cđ từ Asp. niger ............................. 73 4.1.6.2. Thủy phân các loại tinh bột bởi CPE cđ TM ............................................ 73 4.1.7. Xác định khả năng tái sử dụng của chế phẩm enzyme γ- amylase từ Asp. niger và TM để thủy phân bột năng ............................................................................ 73

vii 4.1.7.1. CPE từ Asp. niger ................................................................................... 73 4.1.7.2. CPE thương mại ..................................................................................... 74 4.1.8. Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp. niger thủy phân bột năng tạo glucose ......... 74 4.1.8.1. CPE cđ từ Asp. niger ................................................................................ 74 4.1.8.2. CPE cđ TM ............................................................................................... 74 4.1.9. Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein từ dịch thủy phân bột năng bởi CPE γ- amylase thương mại và từ Asp. niger ........................................................ 74 4.2. Đề nghị .................................................................................................................. 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 72 PHẦN 5: PHỤ LỤC ................................................................................................... 77