Luận án tiến sĩ Y học: Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen EGFR và mối liên quan với lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến

18 Cấu trúc của phân tử EGFR gồm 03 phần: phần liên kết ngoài màng, phần xuyên màng đặc hiệu và phần trong bào tương có hoạt tính tyrosine kinase . + Phần ngoài màng của EGFR (vùng ngoại bào) có trọng lượng khoảng 100 kDa, với hai vùng giàu cystein là nơi để gắn kết các phối tử của EGFR. Vùng gắn kết các yếu tố hoạt hóa hay ức chế các thụ thể, để dẫn truyền tín hiệu vào trong TB, làm TB có thể phát triển bình thường hoặc trở nên ác tính. + Phần xuyên màng tế bào: có trọng lượng nhỏ 3 kDa, tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng. + Phần trong tế bào (vùng nội bào): có trọng lượng khoảng 60 kDa là protein kinase với đuôi tận cùng carboxyl nơi xảy ra phản ứng tự phosphoryl hóa của EGFR. <??3!<N#X05.)et[C*#JcB[! sHQ]5{T?oyp o pt[C*#JcB[!oi(jkpQ^V5.B5>8 J&0EC*#Jc0V"=CB500V  B5 >8#5-]9-]?o'p5.)ei(jkQ9C*#Jc B[!=9C05t[6$|i(jk9C:60EoL]#ap })a5.a0V #5-]9-] S65-65#aX6i(jk9C:6 )J:0E6$|A1c)5.-e5)JPA1?

19 Protein EGFR mang hoạt tính tyrosine kinase, là khởi nguồn của con đường tín hiệu tyrosine kinase trong tế bào. Hoạt tính tyrosine nội bào của EGFR được hoạt hóa khi EGFR liên kết với các phối tử như EGF hoặc yếu tố chuyển dạng (transforming growth factor : TGF). Ngay sau khi được hoạt hóa, vùng nội bào của EGFR sẽ tự phosphoryl hóa, khởi đầu một dòng thác tín hiệu lan tỏa khắp tế bào gây kích hoạt: con đường PI3K/AKT, sự tăng sinh mạch máu, di căn và ức chế quá trình chết theo chương trình (apoptosis), tín hiệu Ras/mitogen activated protein kinase, kích thích phân bào và các con đường dẫn truyền tín hiệu phiên mã , , . Trong các tế bào khỏe mạnh, con đường tín hiệu nội bào trên được kiểm soát một cách nhịp nhàng và chặt chẽ, đảm bảo sự phát triển bình thường của tế bào. Trong các tế bào ung thư, hoạt tính TK của EGFR bị rối loạn bởi các cơ chế phát sinh ung thư, bao gồm đột biến gen i(jk, tăng số lượng bản sao gen i(jk hoặc biểu hiện quá mức protein EGFR . Việc hoạt hóa sai chức năng TK của EGFR làm tăng tỷ lệ phát sinh, tốc độ phát triển, khả năng xâm lấn và di căn của các TB ung thư. <??f5)JPLM#8A1;i(jk sHQ]5']#3?op

20 Gen i(jk đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của một số bệnh ung thư biểu mô ở người: ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ, ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư vú, ung thư tụy, ung thư đại trực tràng và là đích nhắm cho các thế hệ thuốc mới điều trị ung thư. 1.4.2. Đột biến gen  trong ung thư phổi Gen i(jk, nằm trên cánh ngắn NST số 7, dài 110 kb, chia thành 28 exon và được xếp vào nhóm gen tiền sinh ung (proto-oncogen). Đột biến gen i(jk xảy ra ở giai đoạn rất sớm và có tỷ lệ khá cao trong ung thư phổi không tế bào nhỏ. Tỷ lệ đột biến gen i(jk ở bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến châu Á là 51,4%, hay gặp hơn ở bệnh nhân không hút thuốc lá là 60,7% . Tất cả các đột biến gây hoạt hóa EGFR đều thuộc vùng bám adenosine triphosphate (ATP) của thụ thể tyrosine kinase, cũng đồng thời là vị trí tương tác của các loại thuốc ức chế tyrosine kinase của EGFR. Các đột biến gen i(jk thuộc bốn exon mã hóa vùng tyrosine kinase (exon 18 - exon 21) khiến cho protein EGFR luôn trong trạng thái hoạt động không phụ thuộc vào các phối tử, điều đó có tác dụng tăng sự nhạy cảm của khối u hoặc giúp kháng lại các thuốc EGFR TKI , , . Những đột biến này được chia làm ba nhóm: + Đột biến loại I: gồm các đột biến mất đoạn nhỏ ở exon 19, chiếm khoảng 44%. Phổ biến nhất là kiểu đột biến mất acid amin vị trí 747-leucin tới acid amin vị trí 749 - glutamic (đột biến LREA). + Đột biến loại II: gồm các đột biến thay thế một nucleotid làm thay đổi axid amin ở exon 18 và 21. Đột biến điểm thường gặp nhất là đột biến ở exon 21, thay thế arginine bằng leucine ở codon 858 (đột biến L858R). Đột biến này chiếm khoảng 41% của tất cả các đột biến gen i(jk. Một số đột biến khác thuộc nhóm II như đột biến thay thế glycin ở vị trí 719 (G719) thành serin, alanin hoặc cystein chiếm 4% .

21 + Đột biến loại III: gồm các đột biến lặp đoạn hoặc thêm đoạn và đột biến điểm tại exon 20. Đột biến này chiếm khoảng 5% của tất cả các đột biến. Exon 20 chứa hầu hết các đột biến, làm cho tế bào ung thư phổi kháng lại với thuốc điều trị đích, như đột biến điểm T790M, V769L, S768I và các đột biến chèn đoạn. <??fL.)BC]i(jk=;)CA)6>0E *i(jkIq sHQ]5F#F?^?op Cho đến nay, đã có nhiều bằng chứng cho thấy trạng thái cân bằng “tắt - mở” của hoạt tính tyrosine - kinase - EGFR bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi đột biến gen. Những phân tích động học đã chứng minh đột biến làm tăng hệ số phân ly của ATP với EGFR và giảm hệ số phân ly của các thuốc EGFR TKI so với khi thụ thể ở trạng thái bình thường. Những đột biến này khiến EGFR giảm mạnh ái lực với ATP, giúp các thuốc EGFR TKI không phải cạnh tranh tại vị trí tương tác với thụ thể, thụ thể trở nên nhạy cảm đặc biệt với các thuốc này .

22 Trong số các dạng đột biến gen i(jk, đột biến xóa đoạn exon 19 và đột biến điểm L858R chiếm tới gần 90%, được gọi là đột biến hoạt hóa cổ điển. Các đột biến gen i(jk cổ điển thường xảy ra ở những phân nhóm đặc hiệu như các BN có mô bệnh học là ung thư biểu mô tuyến, không hút thuốc, những người thuộc chủng tộc Đông Á và thường là nữ giới. Nghiên cứu của Shigematsu H. (2006) cho thấy có 54% những người không bao giờ hút thuốc có đột biến gen i(jk, trong khi đó chỉ có 16% những người hút thuốc có đột biến gen i(jk. Tần số cao của đột biến gen i(jk gặp ở người không bao giờ hút thuốc cũng phù hợp ở các nhóm dân tộc và địa dư khác nhau. Nghiên cứu IPASS (2011) ở châu Á ghi nhận tỷ lệ đột biến gen i(jk là 59,7% trên BN ung thư phổi biểu mô tuyến . Ngoài ra các số liệu thống kê cho thấy có sự khác biệt về kết quả đáp ứng thuốc giữa các nhóm BN mang các dạng đột biến gen i(jk khác nhau. Những BN có đột biến ở exon 19 và 21 thường đáp ứng rất tốt với các thuốc EGFR TKI . Hơn nữa BN mang đột biến xóa đoạn exon 19 có tỷ lệ đáp ứng thuốc cao hơn và có thời gian sống dài hơn khi được điều trị với liệu pháp ức chế EGFR tyrosine kinase so với BN đột biến điểm ở exon 21. Tuy nhiên những trường hợp ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột biến gen i(jk được điều trị bằng gefitinib hoặc erlotinib sẽ phát triển khả năng kháng các thuốc EGFR TKI. Khoảng trên 50% BN ung thư phổi không tế bào nhỏ được xác định kháng thuốc liên quan tới đột biến kháng thuốc T790M, do sự thay thế threonine bằng methionin ở vị trí acid amin 790 tại exon 20 , . 1.4.3. Một số phương pháp phát hiện đột biến gen  và biểu lộ protein EGFR. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau có thể được áp dụng để xác định sự biểu lộ protein EGFR trên màng tế bào, cũng như phát hiện đột biến gen i(jk, dựa trên cơ sở tỷ lệ tế bào ung thư trong mô phân tích.

23 U<LM.'.G7g Trong những năm gần đây, hóa mô miễn dịch (HMMD) được sử dụng thường quy trong các phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh. Đây là phương pháp nhuộm đặc biệt giúp chẩn đoán phân biệt các khối u, xác định kiểu hình các loại ung thư thông qua việc đánh giá sự biểu lộ các dấu ấn phân tử, trong đó có việc phát hiện sự biểu lộ protein EGFR. Nhuộm HMMD là phương pháp phát hiện gián tiếp sự bộc lộ quá mức của protein EGFR mã hóa bởi các gen i(jk đột biến trên màng TB. Kỹ thuật xác định sự hiện diện và vị trí của kháng nguyên trong các thành phần TB như bào tương, màng và nhân TB bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học thông qua việc xác định sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể. Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, rẻ tiền, tuy nhiên độ chính xác không phải tuyệt đối. Một nghiên cứu của Brevet (2010) về độ nhạy của HMMD phát hiện đột biến gen i(jk exon 19 có độ nhạy là 76-95%. U<9LM.'V3NF+3F*0 Đây là phương pháp thường được sử dụng để xác định các đột biến gen trong ung thư. Tuy nhiên, để đảm bảo cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao thì mật độ TB ung thư trong mô phân tích > 30%. DNA của BN tách chiết từ mẫu mô ung thư được sử dụng để khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho các exon 18 - 21 của gen i(jk. Sản phẩm DNA sau khi tinh sạch được đưa vào giải trình tự trực tiếp và đối chiếu với trình tự của gen i(jk hoang dại trên gen bank để phát hiện đột biến . U9<LM.'X308 EGFR Stripassay là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến và công nghệ lai đầu dò đặc hiệu, để phát hiện các đột biến. Trong đó, nguyên lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNA polymerase. Một phân tử DNA được khuếch đại hoàn

24 chỉnh khi đầu dò 3’của mồi và sợi khuôn bổ sung hoàn toàn với nhau. Khi đầu 3’của mồi không bổ sung với sợi khuôn thì phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn. Dựa trên nguyên lý này kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến đó chiếm một tỷ lệ rất nhỏ (1%) trong tổng số sợi khuôn DNA . Kỹ thuật EGFR Stripassay cho phép phát hiện 16 đột biến có liên quan đến mức độ đáp ứng thuốc của gen i(jk: G719A, G719C và G719S (Exon 18); 10 dạng đột biến xóa đoạn/thêm đoạn thường gặp ở exon 19; T790M (Exon 20); L858R và L861Q (Exon 21). U<U LM  .'  X30  h  b0#i  +i338  [. X8+ \X30b[X^ Scopion ARMS là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpion trong phản ứng Real time PCR, để phát hiện các đột biến. Nguyên lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNA polymerase chỉ khuếch đại hoàn chỉnh 1 phân tử DNA, khi một đầu 3’ của mồi và sợi khuôn bổ sung hoàn toàn với nhau. Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn, phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn. Dựa trên nguyên lý này, kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến, ngay cả trong trường hợp alen đột biến đó, chiếm một tỷ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuôn DNA. Kỹ thuật Scorpion ARMS cho phép phát hiện được 29 dạng đột biến của gen i(jk . 1.4.4. Điều trị đích ung thư phổi biểu mô tuyến Ngày nay, xu hướng điều trị cá thể trong ung thư phổi ngày càng phát triển với các tác nhân điều trị trúng đích (Targeted Therapy) đã mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư phổi . Bước đầu các nghiên cứu cho thấy có hiệu quả trong kéo dài thời gian sống thêm và nâng cao chất lượng sống cho các bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn muộn. Các thuốc điều trị đích gồm hai nhóm:

25 UU=">j Là những thuốc ngăn cản sự gắn kết các phối tử nội sinh với phần ngoại bào của EGFR. Các thuốc được sử dụng trong điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ như cetuximab, pantuximab thường dùng kết hợp với các hóa chất…, . Cetuximab là một kháng thể đơn dòng IgG1 tái tổ hợp tác động trực tiếp lên EGFR ngoài TB, gây ức chế các kết nối receptor, do đó tác động tới quá trình tự phosphorine hóa của EGFR. Điều này dẫn đến ngừng chu kỳ TB, gia tăng các protein của quá trình chết TB theo chương trình. Nghiên cứu hiệu quả của cetuximab kết hợp với các hóa chất chống ung thư dòng thứ nhất, hoặc thứ hai trong điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn III/IV cho thấy tỷ lệ đáp ứng cao hơn (35% so với 28%) và thời gian sống thêm trung bình dài hơn (8,3 tháng so với 7 tháng) so với nhóm BN chỉ điều trị bằng hóa chất đơn thuần. Thử nghiệm lâm sàng pha III FLEX đã kết luận điều trị bước I bộ đôi Cetuximab và hóa chất truyền thống giúp cải thiện thời gian sống cho những BN có mức biểu lộ EGFR cao (chẩn đoán bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch), đặc biệt ở BN ung thư phổi biểu mô tuyến. UU9=. 0$kl Là thuốc ức chế tyrosine kinase của thụ thể EGFR, được dùng như một chất thay thế cho hóa trị liệu ở một số BN. Các chất ức chế tyrosine kinase phân tử lượng nhỏ, cạnh tranh với ATP ở vùng Tyrosine kinase, làm ức chế mạnh sự phosphoryl hóa nội tế bào của EGFR dẫn đến ức chế quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào. Kết quả là ức chế các quá trình: bám dính, xâm lấn, di căn, tăng sinh mạch, tăng sinh tế bào và tăng quá trình chết tế bào theo chương trình và tăng nhạy cảm với hóa trị. Các thuốc phân tử nhỏ được sử dụng bao gồm gefitinib (Iressa) và erlotinib (Tarceva) .

26 Vai trò của erlotinib đã được chứng minh trong các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng về điều trị bước 2,3 (sau thất bại với hóa chất), điều trị duy trì (sau khi điều trị hóa chất ổn định) và điều trị bước 1 trong ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn tiến triển. Một số thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên pha III như thử nghiệm OPTIMAL tại châu Á và thử nghiệm EURTAC tại châu Âu , đã tiến hành so sánh hiệu quả điều trị bước 1 của erlotinib liều 150mg/ngày với hóa chất có platinum, trên các BN ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn IIIB - IV, có đột biến gen i(jk, đã cho kết quả khả quan về tỷ lệ đáp ứng (RR) cũng như cải thiện đáng kể thời gian sống thêm bệnh không tiến triển (PFS). Trong nghiên cứu OPTIMAL, erlotinib giúp kéo dài thời gian sống thêm toàn bộ (OS = 20,7 tháng so với 11,2 tháng p < 0,0001). Tuy nhiên, những trường hợp ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột biến gen i(jk được điều trị bằng gefitinib hoặc erlotinib, luôn phát triển khả năng đề kháng các thuốc EGFR TKI này. Cơ chế phổ biến nhất (khoảng 50%) và được xác định sớm nhất là người bệnh có mang đột biến kháng thuốc T790M ở exon 20 gen i(jk , . 1.4.5. Một số nghiên cứu về đột biến gen  và mối liên quan đến lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến UW,1.(2m#5(%#O)*+ Các nghiên cứu đã chỉ ra tỷ lệ đột biến gen i(jk trên bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến cao hơn ở người châu Á và thay đổi tùy theo từng quốc gia. Nghiên cứu PIONEER (2014) đánh giá tình trạng đột biến gen i(jk trên các bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến châu Á. Kết quả nhận thấy tỷ lệ đột biến i(jk (+) tại: Trung Quốc: 50,2%; Hong Kong: 47,2%; Ấn Độ: 22,2%; Thái Lan: 53,8%; Việt Nam: 64,2% . Tuy nhiên các nhà nghiên cứu chỉ quan tâm tới đột biến từ exon 18 đến exon 21 vì liên quan tới tính đáp

27 ứng với thuốc TKI. Shim H.S. (2011) nghiên cứu phân tích trình tự DNA cho thấy các đột biến mất đoạn và đột biến điểm, phổ biến nhất trong các exon 19 và 21 của vùng kinase với tỷ lệ tương ứng 61,1% và 31,5% . Cho tới nay, có rất nhiều các công bố trong nước về tỷ lệ đột biến gen i(jk và tỷ lệ của các vị trí đột biến từ exon 18 đến exon 21. Nguyễn Minh Hà (2014), áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS xác định đột biến gen i(jk trên 120 mẫu mô ung thư phổi không tế bào nhỏ, được tỷ lệ là 50,8%, trong đó đột biến xóa đoạn LREA tại exon 19 và đột biến điểm L858R chiếm tỷ lệ cao nhất là 44,3% và 37,7%; 9 loại đột biến khác chiếm tỷ lệ thấp hơn . Theo Hoàng Anh Vũ (2014) nghiên cứu trên 332 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ, phát hiện tỷ lệ đột biến gen i(jk là 40,7%. Đột biến xảy ra nhiều nhất ở exon 19 (19%) tiếp đến là exon 21 (16,9%), mỗi exon 18 và 20 cùng xuất hiện đột biến với tỷ lệ 3,6%. Đột biến thường gặp ở bệnh nhân nữ (48,9%) nhiều hơn nam (35%) . Lý do cơ bản của các nghiên cứu về đột biến gen i(jk trên bệnh nhân ung thư phổi vì đột biến này liên quan tới đáp ứng điều trị với các thuốc TKI và tiên lượng của bệnh nhân. Nghiên cứu của Riely G. J. (2006) nhận thấy BN đột biến exon 19 có thời gian sống trung bình dài hơn exon 21 (34 tháng so với 8 tháng, p = 0,01) . '??1;)8#BJE)Ke*i(jkIq Tác giả Bệnh nhân Thuốc n Tỷ lệ đáp ứng so với hóa trị (%) Thời gian sống thêm toàn bộ (tháng) Maemondo M. Châu Á gefitinib 228 73,7 so với 30,7 10,8 so với 5,4 Zhou C. Châu Á erlotinib 154 83 so với 36 13,1 so với 4,6 Rosell R. Châu Âu erlotinib 174 56% so với 15% 9,7 so với 5,2