Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thư da và mối liên quan của nó với các thể bệnh

78 Hình 3.22. Hình ảnh nhuộm HMMD có kết quả đột biến BRAF(V600E) dƣơng tính (độ phóng đại 400 lần) 3.3.2.2. Kết quả biểu lộ protein BRAF đột biến (V600E) trong mô UT da Bảng 3.14. Tỷ lệ biểu lộ protein BRAF(V600E) đột biến ở các mẫu UT da Các loại UT da Số lƣợng Đột biến gen BRAF(V600E) Biểu lộ protein BRAF(V600E) Tỷ lệ % UT TB đáy 21 0 0 0 UT TB vảy 21 0 0 0 UT TB hắc tố 21 1 1 4,8 Tổng số 63 1 1 1,6 Kết quả ở bảng trên cho thấy, 63 mẫu ung thư da, trong đó gồm ung thư tế bào đáy, ung thư tế bào vảy và ung thư tế bào hắc tố, chỉ phát hiện thấy có 1 trường hợp có biểu lộ protein BRAF đột biến V600E ở bệnh nhân Tế bào dương tính

79 ung thư tế bào hắc tố. Đây cũng là bệnh nhân có đột biến gen BRAF (V600E), còn các trường hợp không có đột biến gen BRAF (V600E) thì cũng không thấy biểu lộ protein BRAF (V600E) đột biến.

80 Chƣơng 4 BÀN LUẬN 4.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU Cũng như một số bệnh ung thư khác, ung thư da có liên quan đến một số các đặc trưng cá nhân như tuổi, giới, chủng tộc, nơi sinh sống... của bệnh nhân. Các nghiên cứu ở trong nước và ngoài nước đều cho thấy nguy cơ ung thư da đều liên quan đến tuổi tác, người lớn tuổi thường có nguy cơ dễ mắc ung thư da hơn người trẻ tuổi và có khoảng trên 90% bệnh nhân ung thư da xuất hiện ở lưá tuổi 50 và cao hơn nữa [83],[84],[85]. Nghiên cứu của chúng tôi độ tuổi hay mắc ung thư da nhất cũng từ 40 tuổi trở lên, trong đó cao nhất ở lứa tuổi 50 – 59 và trên 70 tuổi có tỷ lệ tương ứng là 33,3% và 31,7%, ở lứa tuổi dưới 40 tỷ lệ ung thư da là thấp nhất 4,8%. Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu khác ở một số nước trên thế giới [84],[86],[87],[88]. Điều này cho thấy tuổi đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư da. Các nghiên cứu đều cho thấy ung thư da nói chung và đặc biệt là ung thư tế bào đáy thường có liên quan đến tiếp xúc với ánh sáng mặt trời kéo dài và thường xuyên, giống các yếu tố phơi nhiễm khác, tiếp xúc với ánh sáng mặt trời phụ thuộc vào 2 yếu tố, đó là cường độ tiếp xúc và thời gian tiếp xúc. Độ tuổi trung bình của các bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đương với các nghiên cứu khác ở châu Á [84],[89],[90] nhưng cao hơn so với người da trắng [91],[92]. Điều này hoàn toàn hợp lý, người da trắng thường sống ở các nước phát triển có trình độ hiểu biết về bệnh hơn, do đó có điều kiện và khả năng dự phòng chống nắng tốt hơn. Mặt khác người da trắng thường sống ở các nước phát triển do đó họ có điều kiện bảo vệ và tiếp cận với các cơ sở y tế tốt hơn vì thế tỷ lệ mắc ung thư da của họ cũng thấp hơn. Các nghiên cứu về ung thư da ở châu Âu, Mỹ và châu Úc đều cho thấy tỷ lệ ung thư ở nam giới cao hơn so với nữ giới [83],[86],[93]. Trong khi đó,

81 các nghiên cứu ở châu Á đều cho thấy có sự chênh lệch không nhiều giữa nam và nữ [84],[88]. Nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ bệnh ở nam và nữ là gần tương đương nhau, tỷ lệ giới nam/nữ trong số bệnh nhân ung thư da là 1,1. Sự khác biệt về tỷ lệ giới tính nam/nữ trong ung thư da có thể do sự khác nhau về màu da cũng như lối sống, khí hậu và thời gian làm việc ngoài trời. Theo các tác giả ở châu Âu nam giới mắc ung thư da nhiều hơn nữ là do nam giới phải làm những công việc ở ngoài trời nắng (công nhân, trồng trọt). Trong khi đó, nữ giới thường làm các công việc ở trong nhà. Còn ở châu Á, có lẽ tỷ lệ phụ nữ làm các công việc ở ngoài trời nắng nhiều nên tỷ lệ mắc bệnh ở nữ có cao hơn ở nam giới. Ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu của Hoàng Anh Tuấn, về ung thư da loại tế bào đáy vùng mi mắt cũng cho tỷ lệ nữ/nam là 1,1 [94]. 4.2. ĐỘT BIẾN GEN TP53 TRONG UNG THƢ DA Trong các nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh ung thư nói chung và ung thư da nói riêng thì hướng tiếp cận chính là nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm tìm ra các gen gây ung thư hay các tổn thương của hệ di truyền tế bào do các tác nhân tại chỗ hay các tác nhân bên ngoài. Các tác nhân này được truyền vào trong nhân tế bào thông qua các con đường tín hiệu, qua một loạt phản ứng dây chuyền để tác động lên quá trình sao chép DNA và qua đó tham gia sự điều hòa sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Trong hàng loạt các tác nhân gây biến đổi làm rối loạn phân bào, tăng sinh không giới hạn và rối loạn biệt hóa tế bào thì cơ thể cũng có những cơ chế bảo vệ chống lại sự rối loạn đó. Một trong các yếu tố đó là protein p53 do gen TP53 mã hóa có hoạt tính chống sự tăng sinh tế bào, sửa chữa các DNA tổn thương ngăn cản sự đột biến tế bào chống biến chuyển ác tính và trong một số trường hợp gây chết tế bào theo chương trình. Gen TP53 còn được gọi là gen ức chế khối u, nó nằm trên nhánh ngắn thuộc vùng 1, băng 3 băng phụ 1 của NST số 17 (17p13.1). Gen TP53 có kích

82 thước 22.000bp, gồm 11 exon mã hóa cho protein p53 có trọng lượng phân tử 53kDa. Bình thường gen TP53 ở trạng thái không hoạt động. Gen TP53 được hoạt động khi có sự sai lệch về vật chất di truyền nhằm [37],[38],[39]: - Chống tăng sinh tế bào, chống tế bào chuyển ác tính bằng kiểm soát chu kì tế bào, cảm ứng quá trình chết theo chương trình (apoptosis). - Sửa chữa các tổn thương DNA, ngăn cản sự xuất hiện đột biến của tế bào. - Kích thích hoạt tính các gen ức chế ung thư khác, được coi là gen đích của gen TP53. Khi có các đột biến gen TP53 sẽ làm mất chức năng của phân tử protein p53 dẫn đến các tế bào ung thư dễ dàng xuất hiện và phát triển thành mô ung thư. Đột biến gen TP53 là biến đổi di truyền thường gặp nhất trong các loại ung thư ở người. Do gen TP53 điều hòa sự ổn định của bộ gen và ngăn cản tế bào bước vào chu trình phân bào khi có tổn thương DNA nên khi gen TP53 bị đột biến, protein p53 mất chức năng sẽ liên quan đến khả năng ức chế sự phát triển tế bào, do đó sẽ tăng tỷ lệ tế bào sinh sản. Đột biến gen TP53 là biến đổi di truyền hay gặp trong nhiều loại ung thư ở người, đặc biệt là các loại ung thư da, phổi, vú và đại tràng... Các đột biến hầu hết là đột biến điểm trong vùng exon 2 đến 9, kết quả làm cho sản phẩm protein của gen bị mất chức năng nhưng nó lại trở nên bền vững hơn và gây tích tụ với một nồng độ cao trong nhân tế bào, tạo ra các sản phẩm gọi là protein p53 đột biến. Sản phẩm protein p53 được chọn là phân tử của năm 1993, là chìa khóa di truyền của sự phát triển ung thư. Protein p53 có khả năng hạn chế các đột biến xảy ra ở tế bào thông qua tác dụng của nó trên chu kỳ tế bào. Nghiên cứu này chúng tôi tiến hành song song cả hai kỹ thuật giải trình tự gen TP53 và kỹ thuật hóa mô miễn dịch trên cùng một mẫu mô để xác định

83 đột biến. Kỹ thuật giải trình tự gen xác định trình tự các nucleotid trên các đoạn gen TP53, từ đó xác định các đột biến và biến đổi trên gen. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch để xác định biểu lộ phân tử protein p53 đột biến trong mô của các thể ung thư da hay gặp là ung thư tế bào đáy, ung thư tế bào vảy và ung thư tế bào hắc tố. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn 63 bệnh nhân ung thư da đã được chẩn đoán mô bệnh học, gồm 3 thể ung thư da là ung thư tế bào đáy (21 bệnh nhân), ung thư tế bào vảy (21 bệnh nhân) và ung thư tế bào hắc tố (21 bệnh nhân). Các mẫu mô của bệnh nhân được chiết tách DNA và kiểm tra độ tinh sạch và đứt gãy của phân tử DNA đảm bảo cho phản ứng PCR. Gen TP53 được giải trình tự ở 3 đoạn, đoạn 1 từ exon 2 - 4, đoạn 2 từ exon 5 - 6, đoạn 3 từ exon 7 - 9. Khi khuếch đại các đoạn gen TP53 bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi thu được các sản phẩm theo phân đoạn, exon 2 - 4 là 611 bp, exon 5 - 6 là 378 bp và exon 7 - 9 là 755 bp. Các sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng thang chuẩn DNA và cho kết quả phù hợp với kích thước của đoạn gen đã thiết kế. Với kết quả khuếch đại gen này việc giải trình tự các đoạn gen sau này sẽ đảm bảo đúng đoạn gen cần phân tích. Sản phẩm của khuếch đại gen TP53 của các mẫu ung thư da thu được bao gồm trình tự từ exon 2 đến exon 9, trong đó bao gồm cả các đoạn exon và intron (intron1 - IVS1, exon 2, IVS2, exon 3, IVS3, exon 4, IVS4, exon 5, IVS5, exon 6, IVS6, exon 7, IVS 7, exon 8, IVS8, exon 9, IVS9). Đây cũng là các đoạn gen được các tác giả nước ngoài nghiên cứu và cho thấy thường có biến đổi khi bệnh nhân bị ung thư da [95],[96],[97],[98]. 4.2.1. Phân loại các biến đổi ở các đoạn gen TP53 Khi phân tích gen TP53 ở các mẫu ung thư da các loại, chúng tôi đều phát hiện được sự biến đổi gen TP53 ở 100% các mẫu nghiên cứu. Các biến

84 đổi này phát hiện thấy có cả ở vùng intron (IVS) là vùng không mã hóa và vùng exon là vùng mã hóa chi phối tổng hợp phân tử protein. Đồng thời gặp rất nhiều loại biến đổi nucleotid trên các đoạn gen TP53 khác nhau, tổng số loại biến đổi chúng tôi gặp là 52 loại. Trong đó, vị trí biến đổi nucleotid xuất hiện trên các đoạn exon là 10 loại, ở vùng intron có đến 42 loại. Các biến đổi phần lớn ở trạng thái đồng hợp tử, một số ít ở trạng thái dị hợp tử, như các biến đổi: g.11827-11828insC (IVS1); g.12139C>G (exon 3); g.13150C>T và g.13151C>T (exon 4); g.13248G>A; g.13451G>C (IVS5); g.14133C>A, g.14183T>C, g.14189T>C và g.14203G>T (IVS6). Biến đổi g.12139C>A ở exon 3 gặp với tỷ lệ khá cao, biến đổi ở exon 4 chỉ có 2 loại thì cả 2 loại này đều gặp dị hợp tử. Tuy nhiên, các biến đổi xảy ra hầu hết là biến đổi phối hợp, nên trong 1 mẫu nếu có biến đổi dị hợp với một exon nào đó thì cũng lại còn một biến đổi ở exon khác. Với biến đổi trên gen TP53, người ta chia 2 loại là: - Đa hình di truyền là trường hợp biến đổi ở vùng intron và không ảnh hưởng đến các exon tiếp theo hoặc có thay thế hoặc đảo nucleotid nhưng mã di truyền vẫn quy định acid amin như gen hoang dã. Trường hợp này protein do gen quy định không có thay đổi acid amin. - Đột biến là trường hợp thay đổi trình tự các nucleotid ở trên gen dẫn đến thay đổi các mã di truyền gây ra thay đổi acid amin trong phân tử protein do gen đó quy định. Khi cấu trúc của phân tử protein bị thay đổi, chức năng của phân tử cũng biến đổi, có thể làm hoạt tính của phân tử protein bị giảm hoặc mất đi. * Biến đổi ở các đoạn intron Các biến đổi trên vùng intron là các biến đổi đa hình di truyền, các biến đổi này không làm thay đổi cấu trúc và chức năng của phân tử protein. Một số

85 biến đổi trên vùng intron cũng tác động tới quá trình tổng hợp phân tử protein. Trong các biến đổi xảy ra ở vùng intron, thì chủ yếu gặp ở vùng IVS1, IVS5 và IVS6, các vùng intron còn lại là IVS2, IVS3, IVS4, IVS7, IVS8 đều không phát hiện thấy có biến đổi. Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, các biến đổi trên vùng IVS1 có 6 biến đổi, trong đó chủ yếu là biến đổi thay thế và chèn thêm nuleotid xảy ra ở các vị trí g.11818-11819insC, 11874-11875C chiếm tỷ lệ lần lần lượt là 30,2% và 73,0%, biến đổi chèn thêm nucleeotid ở vị trí g11827-11828C có tỷ lệ thấp hơn 6,3% trong các mẫu ung da, biến đổi thay thế nucleotid g.11827C>G, 11849G>A và 11903T>A đều chiếm tỷ lệ khá thấp (1,6%). Đặc biệt biến đổi chèn nucleotid ở vị trí g.11874-11875insC xảy ra 100% ở các các mẫu ung thư tế bào hắc tố. Các biến đổi nucleoid ở vùng intron hầu hết không ảnh hưởng gì đến biểu hiện gen, nhất là các thay thế, đảo vị trí của nucleotide không gây ra hậu quả gì, loại biến đổi này lại là biến đổi nhiều nhất. Tuy nhiên với các đột biến chèn nucleotide hoặc mất nucleotide thì đôi khi có thể ảnh hưởng đến exon tiếp theo của intron này. Việc cả một vùng của exon 2 trình tự nucleotid không thể so sánh được với trình tự gen gốc cần được nghiên cứu tiếp vì khi tham khảo các nghiên cứu của các tác giả khác thì họ cũng chỉ đưa ra nhận xét là có nhiều biến đổi ở vùng intron chứ không bình luận, liệu có loại nào trong số này có thể gây ảnh hưởng đến exon tiếp theo. Các tác giả cũng chủ yếu phân tích các biến đổi nucleotid ở các vùng exon. Ở vùng IVS2, IVS3, IVS4 không phát hiện thấy có biến đổi trình tự nucleotid ở tất cả các mẫu ung thư da. Vùng IVS5, chỉ phát hiện được 1 biến đổi nucleotid vị trí g.13451 thay thế nucleotid Guanine thành Cytosine (g.13451G>C). Biến đổi này cũng chỉ quan sát thấy ở 1 mẫu ung thư tế bào đáy, còn ung thư tế bào vảy và ung thư

86 tế bào hắc tố đều không phát hiện được. Các biến đổi xảy ra ở IVS6 gặp với tần suất cao, trong đó ung thư tế bào đáy cũng chiếm chủ yếu các biến đổi ở IVS6, tiếp đó là ung thư tế bào vảy và cuối cùng là ung thư tế bào hắc tố. Mặc dù số lượng các biến đổi IVS6 ở ung thư tế bào hắc tố ít, nhưng là toàn bộ mẫu xảy ra cùng một biến đổi. Trong số 35 biến đổi của vùng IVS6, có 3 biến đổi chèn thêm nucleotid trên đoạn IVS6 của gen là g.14245-14246insG, g.14247-14248insG và g.14251-14252insG, 32 biến đổi là thay thế nucleotid ở các vị trí g.14129C>A, g.14181C>T, g.14133C>A, g.14170T>G, g.14177G>T, g.14187T>G, g.14183T>C, g.14185T>C, g.14189T>C, g.14201T>G, g.14203G>T, g.14236T>C, g.14237T>C, g.14238C>T, g.14239C>T, g.14242T>C, g.14274T>C, g.14276T>C, g.14280C>T, g.14319A>C, g.14320C>A, g.14321A>C, g.14322C>A, g.14322C>T, g.14323T>A, g.14324T>C, g.14325C>A, g.14325A>T, g.14326C>A, g.14328T>C, g.14329A>T g.14243T>C. Những biến đổi thay thế và chèn thêm nucleotid xảy ra ở IVS là vùng không mã hóa vì vậy về lý thuyết sẽ không làm biến đổi các acid amin của phân tử protein. Các vùng intron IVS7, IVS8 cũng không phát hiện thấy có biến đổi trình tự nucleotid ở tất cả các mẫu ung thư da. Các biến đổi phần lớn là thay thế nucleotid này bằng nucleotid khác, hiện tượng này xảy ra ở hầu hết các đoạn gen được phân tích và tìm thấy biến đổi. Với loại biến đổi chèn nucleotid thì cả 6 loại mà chúng tôi gặp đều ở các vùng intron, 3 loại gặp ở IVS1, 3 loại còn lại gặp ở IVS6. Kết quả này cũng tương tự kết quả của các tác giả khác [97], [99], [100],[101],[102],[103],[104],[105]. Ảnh hưởng của các biến đổi này như thế nào, liệu có gây thay đổi mã di truyền ở exon tiếp theo hay không cần có đánh giá ở các nghiên cứu tiếp theo vì trong nghiên cứu này chúng tôi gặp chủ yếu là các biến đổi phối hợp. Trên 1 bệnh nhân có thể gặp nhiều biến đổi nucleotide ở các vị trí khác nhau, cả trên intron đồng thời lại có cả ở exon nên chưa đưa ra

87 được nhận xét gì về các thay đổi chèn thêm nucleotid ở các vùng intron. Có lẽ các tác giả nghiên cứu trước đây cũng gặp tình trạng tương tự nên nhìn chung họ đều chỉ tập trung bàn và phân tích các biến đổi nucleotid ở các vùng exon. * Biến đổi ở các đoạn exon Khi giải trình tự gen TP53 các đoạn từ exon 2 đến exon 9 ở các mẫu mô bệnh nhân ung da, đây là vùng thường xảy ra đột biến của gen TP53 [101],[103],[104],[105],[106]. Kết quả chúng tôi phát hiện 10 vị trí biến đổi nucleotid nằm rải rác trên các đoạn exon. Các biến đổi là các đột biến điểm xảy ra ở exon 3, exon 4 và exon 6, không thấy các biến đổi ở exon 2, exon 5 và exon 7 đến exon 9. Trong các biến đổi ở exon, khi so sánh với genebank, ở 10 loại biến đổi phát hiện được, chúng tôi thấy có 8 biến đổi nucleotid có sự thay đổi acid amin trong phân tử protein, đây chính là các đột biến của gen TP53. Có 2 loại biến đổi thay thế nucleotid tại vị trí g.13150C>T ở exon 4 và g14062C>A, cả 2 biến đổi này đều không gây ra sự thay đổi acid amin của phân tử protein. Ở đoạn exon 3, có 5 vị trí đột biến, tất cả các đột biến này đều là đột biến thay thế các nucleotid, sự thay thế này đều làm thay đổi acid amin trên phân tử protein. Ở vị trí g.12072 của gen TP53 Adenine được thay thế bằng Guanine (g.12112A>G) dẫn đến acid amin ở vị trí 63 biến đổi từ Alanin thành Serine (p.A63S). Tương tự như vậy ở vị trí g.12139 biến đổi Cytosine được thay thế bằng Adenine (g12139C>A), làm cho acid amin ở vị trí 72 bị biến đổi từ Proline hoặc Histamine (p.P72H). Vị trí g12143T>A trên gen TP53 bị thay thế Thymine bằng Adenine làm phân tử protein bị đột biến ở acid amin 73 chuyển Valine thành Glutamate (p.V73E). Vị trí g.12145 của gen Guanine thay thế bằng Thymine (g12145G>T), sự thay thế này làm thay đổi acid amin ở vị trí 74 Alanine thành Serine (p.A74S). Tại vị trí g12239, thay thế nucleotid Guanine bằng Adenine (g.12239G>A), làm biến đổi acid amin ở vị