Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thư da và mối liên quan của nó với các thể bệnh

9,833
170
140
58
Hình 3.2. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ exon 5 6 (378bp)
Hình 3.3. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ exon 7 9 (755bp)
3.2.1.2. Các vị trí đột biến trên các exon gen TP53
Các đoạn mồi được thiết kế để nhân các đoạn nhỏ của gen TP53 từ
exon 2 đến exon 9. Quá trình khuếch đại gen TP53 từ exon 2 đến exon 9
được chia thành 3 đoạn gen: exon 2 - 4, exon 5 - 6 và exon 7 - 9. Sản phẩm
giải trình tự gen TP53 của các mẫu ung thư da thu được bao gồm trình tự từ
exon 2 cho đến exon 9 (trong đó có cả trình tự của intron 1 - IVS1, exon 2,
IVS2, exon 3, IVS3, exon 4, IVS4, exon 5, IVS5, exon 6, IVS6, exon 7,
IVS7, exon 8, IVS8, exon 9).
0,378kb
0,755kb
58 Hình 3.2. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ exon 5  6 (378bp) Hình 3.3. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ exon 7  9 (755bp) 3.2.1.2. Các vị trí đột biến trên các exon gen TP53 Các đoạn mồi được thiết kế để nhân các đoạn nhỏ của gen TP53 từ exon 2 đến exon 9. Quá trình khuếch đại gen TP53 từ exon 2 đến exon 9 được chia thành 3 đoạn gen: exon 2 - 4, exon 5 - 6 và exon 7 - 9. Sản phẩm giải trình tự gen TP53 của các mẫu ung thư da thu được bao gồm trình tự từ exon 2 cho đến exon 9 (trong đó có cả trình tự của intron 1 - IVS1, exon 2, IVS2, exon 3, IVS3, exon 4, IVS4, exon 5, IVS5, exon 6, IVS6, exon 7, IVS7, exon 8, IVS8, exon 9). 0,378kb 0,755kb
59
Bảng 3.3. Các loại đột biến gen TP53 trên các đoạn exon
ở các mẫu ung thƣ da (n=63)
STT
Đoạn
exon
Vị trí biến
đổi trên gen
Vị trí biến
đổi trên
cDNA
Codon thay
đổi
Vị trí biến
đổi acid
amin
1
Exon 3
g.12112G>T
c.187G>T
GCT TCT
p.A63S(*)
g.12139C>A
c.215C>A
CCC CAC
p.P72H
g.12143T>A
c.218T>A
GTG GAG
p.V73E(*)
g.12145G>T
c.220G>T
GCC TCC
p.A74S(*)
g.12239G>A
c.314G>A
GGC GAC
p.G105D(*)
2
Exon 4
g.13150C>T
c.471C>T
GTC GTT
p.V157V
g.13151C>T
c.472C>T
CGC TGC
p.R158C
3
Exon 6
g.14049C>T
c.722C>T
TCC TTC
p.S241F
g.14060G>T
c.733G>T
GGC TGC
p.G245C
g.14062C>A
c.735C>A
GGC GGA
p.G245G
Khi phân tích gen TP53 các đoạn từ exon 2 đến exon 9 ở các mẫu ung
thư da, phát hiện được 10 đột biến, các đột biến này đều nằm ở exon 3, exon
4 và exon 6, không phát hiện được các đột biến ở exon 2, exon 5, exon 7
exon 8. Có hai đột biến đồng thời xảy ra tại exon 6 là đột biến c.733G>T và
c.735C>A, đột biến này xảy ra tại 1 codon, GGC hóa cho acid amin
Glycine (G) bị biến đổi thành TGA là mã kết thúc (X).
Có 2 đột biến không gây thay đổi acid amin: 1 xảy ra ở exon 4, vị trí
biến đổi trên bộ gen g.13150C>T, vị trí tương ứng trên cDNA
c.471C>T, qui định GTC bị biến đổi thành GTT, nhưng acid amin
không thay đổi do cả hai bộ ba này đều hóa cho acid amin valine, một
loại biến đổi nữa là ở exon 6, vị trí biến đổi trên bộ gen là g.14062C>A, vị trí
tương ứng trên cDNA là c.735C>A, có sự thay thế Adenine thành Cytosine,
mã quy định là GGC nay bị đổi thành GGA nhưng acid amin không thay đổi
59 Bảng 3.3. Các loại đột biến gen TP53 trên các đoạn exon ở các mẫu ung thƣ da (n=63) STT Đoạn exon Vị trí biến đổi trên gen Vị trí biến đổi trên cDNA Codon thay đổi Vị trí biến đổi acid amin 1 Exon 3 g.12112G>T c.187G>T GCT  TCT p.A63S(*) g.12139C>A c.215C>A CCC  CAC p.P72H g.12143T>A c.218T>A GTG GAG p.V73E(*) g.12145G>T c.220G>T GCC  TCC p.A74S(*) g.12239G>A c.314G>A GGC  GAC p.G105D(*) 2 Exon 4 g.13150C>T c.471C>T GTC  GTT p.V157V g.13151C>T c.472C>T CGC  TGC p.R158C 3 Exon 6 g.14049C>T c.722C>T TCC  TTC p.S241F g.14060G>T c.733G>T GGC TGC p.G245C g.14062C>A c.735C>A GGC GGA p.G245G Khi phân tích gen TP53 các đoạn từ exon 2 đến exon 9 ở các mẫu ung thư da, phát hiện được 10 đột biến, các đột biến này đều nằm ở exon 3, exon 4 và exon 6, không phát hiện được các đột biến ở exon 2, exon 5, exon 7 và exon 8. Có hai đột biến đồng thời xảy ra tại exon 6 là đột biến c.733G>T và c.735C>A, đột biến này xảy ra tại 1 codon, GGC mã hóa cho acid amin Glycine (G) bị biến đổi thành TGA là mã kết thúc (X). Có 2 đột biến không gây thay đổi acid amin: 1 xảy ra ở exon 4, vị trí biến đổi trên bộ gen là g.13150C>T, vị trí tương ứng trên cDNA là c.471C>T, mã qui định là GTC bị biến đổi thành GTT, nhưng acid amin không thay đổi do cả hai bộ ba này đều mã hóa cho acid amin valine, một loại biến đổi nữa là ở exon 6, vị trí biến đổi trên bộ gen là g.14062C>A, vị trí tương ứng trên cDNA là c.735C>A, có sự thay thế Adenine thành Cytosine, mã quy định là GGC nay bị đổi thành GGA nhưng acid amin không thay đổi
60
vẫn qui định Glycine. Trong 10 đột biến vùng exon này 6 đột biến đã
được các tác giả khác công bố, còn 4 đột biến chưa thấy tác giả nào công bố
được đánh dấu (*) đều là các đột biến trên exon 3.
3.2.1.3. Các vị trí đột biến trên các intron gen TP53
Bảng 3.4. Các loại biến đổi gen TP53 trên các đoạn intron
ở các mẫu ung thƣ da (n=63)
STT
Đoạn
intron
Vị trí biến đổi trên gen
1
IVS1
(6 biến
đổi)
g.11827C>G, g.11849G>A, g.11903T>A,
g.11818-11819insC, g.11827-11828insC,
g.11874-11875insC
2
IVS5
(1 biến
đổi)
g.13451G>C
3
IVS6
(35 biến
đổi)
g.14129C>A, g.14181C>T, g.14133C>A, g.14170T>G,
g.14177G>T, g.14187T>G, g.14183T>C, g.14185T>C,
g.14189T>C, g.14201T>G, g.14203G>T, g.14236T>C,
g.14237T>C, g.14238C>T, g.14239C>T, g.14242T>C,
g.14243T>C, g.14245-14246insG, g.14247-14248insG,
g.14251-14252insG, g.14274T>C, g.14276T>C,
g.14280C>T, g.14319A>C, g.14320C>A, g.14321A>C,
g.14322C>A, g.14322C>T, g.14323T>A, g.14324T>C,
g.14325C>A, g.14325A>T, g.14326C>A, g.14328T>C,
g.14329A>T
Phân tích trình tự các nucleotid trên các đoạn intron, phát hiện được
tổng số 42 biến đổi trên vùng intron của các mẫu ung thư da, trong đó chỉ
phát hiện biến đổi đoạn IVS1, IVS5, IVS6, không thấy các biến đổi trên
các đoạn IVS2, IVS3, IVS4, IVS7 IVS8. đoạn IVS1, 6 biến đổi,
60 vẫn qui định Glycine. Trong 10 đột biến ở vùng exon này có 6 đột biến đã được các tác giả khác công bố, còn 4 đột biến chưa thấy tác giả nào công bố được đánh dấu (*) đều là các đột biến trên exon 3. 3.2.1.3. Các vị trí đột biến trên các intron gen TP53 Bảng 3.4. Các loại biến đổi gen TP53 trên các đoạn intron ở các mẫu ung thƣ da (n=63) STT Đoạn intron Vị trí biến đổi trên gen 1 IVS1 (6 biến đổi) g.11827C>G, g.11849G>A, g.11903T>A, g.11818-11819insC, g.11827-11828insC, g.11874-11875insC 2 IVS5 (1 biến đổi) g.13451G>C 3 IVS6 (35 biến đổi) g.14129C>A, g.14181C>T, g.14133C>A, g.14170T>G, g.14177G>T, g.14187T>G, g.14183T>C, g.14185T>C, g.14189T>C, g.14201T>G, g.14203G>T, g.14236T>C, g.14237T>C, g.14238C>T, g.14239C>T, g.14242T>C, g.14243T>C, g.14245-14246insG, g.14247-14248insG, g.14251-14252insG, g.14274T>C, g.14276T>C, g.14280C>T, g.14319A>C, g.14320C>A, g.14321A>C, g.14322C>A, g.14322C>T, g.14323T>A, g.14324T>C, g.14325C>A, g.14325A>T, g.14326C>A, g.14328T>C, g.14329A>T Phân tích trình tự các nucleotid trên các đoạn intron, phát hiện được tổng số có 42 biến đổi trên vùng intron của các mẫu ung thư da, trong đó chỉ phát hiện biến đổi ở đoạn IVS1, IVS5, IVS6, không thấy các biến đổi trên các đoạn IVS2, IVS3, IVS4, IVS7 và IVS8. Ở đoạn IVS1, có 6 biến đổi,
61
đoạn IVS5 chỉ có 1 biến đổi, đoạn IVS6 xảy ra nhiều biến đổi nhất,
tổng cộng đoạn này xảy ra 35 biến đổi. Các biến đổi hầu hết thay
thế và chèn thêm nucleotid.
3.2.1.4. Một số hình ảnh biến đổi gen TP53 qua phân tích gen bằng phương
pháp xác định trình tự gen
A
B
A. Wild type; B. Biến đổi g.11827G>C
Hình 3.4. Biến đổi g.11827G>C ở IVS1
120 130
A
B
A. Wild type; B. Biến đổi g.11818-11819insC
Hình 3.5. Biến đổi g.11818-11819insC ở IVS1
61 đoạn IVS5 chỉ có 1 biến đổi, đoạn IVS6 xảy ra nhiều biến đổi nhất, tổng cộng đoạn này xảy ra 35 biến đổi. Các biến đổi hầu hết là thay thế và chèn thêm nucleotid. 3.2.1.4. Một số hình ảnh biến đổi gen TP53 qua phân tích gen bằng phương pháp xác định trình tự gen A B A. Wild type; B. Biến đổi g.11827G>C Hình 3.4. Biến đổi g.11827G>C ở IVS1 120 130 A B A. Wild type; B. Biến đổi g.11818-11819insC Hình 3.5. Biến đổi g.11818-11819insC ở IVS1
62
A
180 190
B
A. Wild type; B. Biến đổi g.11874-11875insC
Hình 3.6. Biến đổi g.11874-11875insC ở IVS1
A
B
p.P72H (CCC: Proline
CAC: Histidine )
A. Wild type; B. đột biến g.12139C>A
Hình 3.7. Đột biến g.12319C>A (c.215C>A) ở exon 3
62 A 180 190 B A. Wild type; B. Biến đổi g.11874-11875insC Hình 3.6. Biến đổi g.11874-11875insC ở IVS1 A B p.P72H (CCC: Proline  CAC: Histidine ) A. Wild type; B. đột biến g.12139C>A Hình 3.7. Đột biến g.12319C>A (c.215C>A) ở exon 3
63
A
B
p.G245X (GGC: Glycine
TGA: X - mã kết thúc)
A. Wild type; B. Đột biến kép g.14060G>T và g.14062C>A
Hình 3.8. Đột biến kép g.14060G>T và g.14062C>A
(c.733G>T + c.735C>A) ở exon 6
A
B
Biến đổi hai nucleotid liên tiếp thuộc 2 codon khác nhau
p.V157V (GTC: Valine
GTT: Valine);
p.R158C (CGC: Arginine
TGC: Cysteine)
A. Wild type; B. Đột biến g.13150CC>TT (dị hợp tử)
Hình 3.9. Đột biến g.13150C>T và g.13151C>T (g.13150C>T) ở exon 4
63 A B p.G245X (GGC: Glycine  TGA: X - mã kết thúc) A. Wild type; B. Đột biến kép g.14060G>T và g.14062C>A Hình 3.8. Đột biến kép g.14060G>T và g.14062C>A (c.733G>T + c.735C>A) ở exon 6 A B Biến đổi hai nucleotid liên tiếp thuộc 2 codon khác nhau p.V157V (GTC: Valine  GTT: Valine); p.R158C (CGC: Arginine  TGC: Cysteine) A. Wild type; B. Đột biến g.13150CC>TT (dị hợp tử) Hình 3.9. Đột biến g.13150C>T và g.13151C>T (g.13150C>T) ở exon 4
64
A
160 170
B
A. Wild type; B. Biến đổi g.14177G>T
Hình 3.10. Biến đổi g.14177G>T ở IVS6
A
230 240
B
A. Wild type; B. Biến đổi g.14242TT>CC
Hình 3.11. Biến đổi g.14242T>C và 14243T>C (g.14242TT>CC) ở IVS6
64 A 160 170 B A. Wild type; B. Biến đổi g.14177G>T Hình 3.10. Biến đổi g.14177G>T ở IVS6 A 230 240 B A. Wild type; B. Biến đổi g.14242TT>CC Hình 3.11. Biến đổi g.14242T>C và 14243T>C (g.14242TT>CC) ở IVS6
65
A
240 250
B
A. Wild type; B. Biến đổi g.14251-14252insG
Hình 3.12. Biến đổi g.14251-14252insG ở IVS6
3.2.1.4. Tỷ lệ biến đổi đoạn gen TP53 ở các mẫu ung thư da
* Tỷ lệ biến đổi các đoạn gen TP53 ở từng loại ung thư da
Bảng 3.5. Tỷ lệ biến đổi gen TP53 của các thể ung thƣ da
Loại
biến
đổi gen
TP53
UT TB đáy
(n=21)
UT TB vảy
(n=21)
UT TB hắc tố
(n=21)
Tổng số
(n=63)
Số
lƣợng
Tỷ lệ
%
Số
lƣợng
Tỷ lệ %
Số
lƣợng
Tỷ lệ
%
Số
lƣợng
Tỷ lệ
%
Có biến
đổi gen
TP53
21
100
21
100
21
100
63
100
Exon
14
66,7
3
14,3
0
0
17
27,0
Intron
18
85,7
21
100
21
100
60
95,2
Cả
exon và
intron
11
52,4
3
14,3
0
0
14
22,2
65 A 240 250 B A. Wild type; B. Biến đổi g.14251-14252insG Hình 3.12. Biến đổi g.14251-14252insG ở IVS6 3.2.1.4. Tỷ lệ biến đổi đoạn gen TP53 ở các mẫu ung thư da * Tỷ lệ biến đổi các đoạn gen TP53 ở từng loại ung thư da Bảng 3.5. Tỷ lệ biến đổi gen TP53 của các thể ung thƣ da Loại biến đổi gen TP53 UT TB đáy (n=21) UT TB vảy (n=21) UT TB hắc tố (n=21) Tổng số (n=63) Số lƣợng Tỷ lệ % Số lƣợng Tỷ lệ % Số lƣợng Tỷ lệ % Số lƣợng Tỷ lệ % Có biến đổi gen TP53 21 100 21 100 21 100 63 100 Exon 14 66,7 3 14,3 0 0 17 27,0 Intron 18 85,7 21 100 21 100 60 95,2 Cả exon và intron 11 52,4 3 14,3 0 0 14 22,2
66
Bảng 3.5 cho thấy 100% các mẫu ung thư da biến đổi gen TP53
trong đó tỷ lệ đột biến các đoạn exon trong ung thư da chiếm 27,0 % trong
tổng số 63 bệnh nhân nghiên cứu, trong đó loại ung thư tế bào đáy cao
nhất chiếm 66,7%, ung thư tế bào vảy 14,3%, không phát hiện thấy đột
biến exon trong loại ung thư tế bào hắc tố. Biến đổi trong các đoạn intron
của ung thư da tỷ lệ khá cao chiếm 95,2% trong tổng số ung thư da nói
chung. Biến đổi phối hợp các đoạn exon và intron chiếm tỷ lệ 22,2%.
Bảng 3.6. Tỷ lệ biến đổi các đoạn gen TP53 của từng loại ung thƣ da
Đoạn
gen
TP53
UT TB đáy
(n=21)
UT TB vảy
(n=21)
UT TB hắc tố
(n=21)
Tổng số
(n=63)
Số
lƣợng
Tỷ lệ
%
Số
lƣợng
Tỷ lệ
%
Số
lƣợng
Tỷ lệ
%
Số
lƣợng
Tỷ lệ
%
IVS1
12
57,1
21
100
21
100
54
85,7
Exon 3
13
61,9
3
14,3
0
0
16
25,4
Exon 4
1
4,8
0
0
0
0
1
1,6
IVS5
1
4,8
0
0
0
0
1
1,6
Exon 6
8
38,1
0
0
0
0
8
12,7
IVS6
12
57,1
16
76,2
21
100
49
77,8
mẫu ung thư tế bào đáy, các biến đổi tập trung các đoạn IVS1,
exon 3 và IVS6 (57,1%, 61,9% và 57,1%), có 38,1% đột biến xảy ra ở exon
6. Đối với mẫu ung thư tế bào vảy, biến đổi xảy ra đoạn là IVS1 (100%),
IVS6 (76,2%) và exon 3 (14,3%). Đối với ung thư tế bào hắc tố, biến đổi xảy
ra ở 2 đoạn intron là IVS1 và IVS6, đều chiếm 100%.
66 Bảng 3.5 cho thấy 100% các mẫu ung thư da có biến đổi gen TP53 trong đó tỷ lệ đột biến ở các đoạn exon trong ung thư da chiếm 27,0 % trong tổng số 63 bệnh nhân nghiên cứu, trong đó loại ung thư tế bào đáy là cao nhất chiếm 66,7%, ung thư tế bào vảy là 14,3%, không phát hiện thấy đột biến exon trong loại ung thư tế bào hắc tố. Biến đổi trong các đoạn intron của ung thư da có tỷ lệ khá cao chiếm 95,2% trong tổng số ung thư da nói chung. Biến đổi phối hợp các đoạn exon và intron chiếm tỷ lệ 22,2%. Bảng 3.6. Tỷ lệ biến đổi các đoạn gen TP53 của từng loại ung thƣ da Đoạn gen TP53 UT TB đáy (n=21) UT TB vảy (n=21) UT TB hắc tố (n=21) Tổng số (n=63) Số lƣợng Tỷ lệ % Số lƣợng Tỷ lệ % Số lƣợng Tỷ lệ % Số lƣợng Tỷ lệ % IVS1 12 57,1 21 100 21 100 54 85,7 Exon 3 13 61,9 3 14,3 0 0 16 25,4 Exon 4 1 4,8 0 0 0 0 1 1,6 IVS5 1 4,8 0 0 0 0 1 1,6 Exon 6 8 38,1 0 0 0 0 8 12,7 IVS6 12 57,1 16 76,2 21 100 49 77,8 Ở mẫu ung thư tế bào đáy, các biến đổi tập trung ở các đoạn IVS1, exon 3 và IVS6 (57,1%, 61,9% và 57,1%), có 38,1% đột biến xảy ra ở exon 6. Đối với mẫu ung thư tế bào vảy, biến đổi xảy ra ở đoạn là IVS1 (100%), IVS6 (76,2%) và exon 3 (14,3%). Đối với ung thư tế bào hắc tố, biến đổi xảy ra ở 2 đoạn intron là IVS1 và IVS6, đều chiếm 100%.
67
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy, biến đổi gặp nhiều nhất ở IVS1 và IVS6.
Các đột biến ở các exon chỉ gặp ở exon 3, exon 4 và exon 6, và gặp chủ yếu
trong ung thư tế bào đáy với tỷ lệ tương ứng là 61,9%, 4,8% và 38,1%. Ung
thư tế bào vảy cũng gặp các đột biến ở exon 3 với tỷ lệ 14,3%. Ở ung thư tế
bào hắc tố thì không gặp các đột biến ở các vùng exon. Trong các biến đổi ở
các đoạn gen TP53, một loại biến đổi có thể xảy ra ở nhiều mẫu và một mẫu
có thể gặp nhiều biến đổi.
* Biến đổi ở đoạn IVS1
Bảng 3.7. Biến đổi ở đoạn IVS1 trong các loại ung thƣ da
STT
Vị trí biến
đổi
UT
TB đáy
(n=21)
UT
TB vảy
(n=21)
UT
TB hắc tố
(n=21)
Tổng (n=63)
n
%
1
g.11818-
11819insC
1
18
0
19
30,2
2
g.11827C>G
1
0
0
1
1,6
3
g.11827-
11828insC
0
4
0
4
6,3
4
g.11849G>A
1
0
0
1
1,6
5
g.11874-
11875insC
12
13
21
46
73,0
6
g.11903T>A
1
0
0
1
1,6
Trong các ng IVS1 phát hiện có 6 vị trí biến đổi trong đó có 3 vị trí
biến đổi chèn thên nucleotid, 3 vị trí thay thế nucleotid. Các biến đổi chèn
67 Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy, biến đổi gặp nhiều nhất ở IVS1 và IVS6. Các đột biến ở các exon chỉ gặp ở exon 3, exon 4 và exon 6, và gặp chủ yếu trong ung thư tế bào đáy với tỷ lệ tương ứng là 61,9%, 4,8% và 38,1%. Ung thư tế bào vảy cũng gặp các đột biến ở exon 3 với tỷ lệ 14,3%. Ở ung thư tế bào hắc tố thì không gặp các đột biến ở các vùng exon. Trong các biến đổi ở các đoạn gen TP53, một loại biến đổi có thể xảy ra ở nhiều mẫu và một mẫu có thể gặp nhiều biến đổi. * Biến đổi ở đoạn IVS1 Bảng 3.7. Biến đổi ở đoạn IVS1 trong các loại ung thƣ da STT Vị trí biến đổi UT TB đáy (n=21) UT TB vảy (n=21) UT TB hắc tố (n=21) Tổng (n=63) n % 1 g.11818- 11819insC 1 18 0 19 30,2 2 g.11827C>G 1 0 0 1 1,6 3 g.11827- 11828insC 0 4 0 4 6,3 4 g.11849G>A 1 0 0 1 1,6 5 g.11874- 11875insC 12 13 21 46 73,0 6 g.11903T>A 1 0 0 1 1,6 Trong các vùng IVS1 phát hiện có 6 vị trí biến đổi trong đó có 3 vị trí biến đổi chèn thên nucleotid, 3 vị trí thay thế nucleotid. Các biến đổi chèn