Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thư da và mối liên quan của nó với các thể bệnh
10,495
170
140
38
nucleotide đóng vai trò như một khóa dừng phản ứng polymer hóa, do đó sau
khi mỗi dNTP được tích hợp, dye huỳnh quang được ghi lại để xác định
nucleotide và sau đó bị cắt bỏ để tổng hợp nucleotide tiếp theo. Vì cả 4 loại
dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuận nghịch có mặt đồng thời dưới dạng đơn
phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúp giảm thiểu việc tổng hợp mất cân đối.
Việc xác định các base dựa vào cường độ tín hiệu đo được trong mỗi chu
trình, giúp giảm thiểu các sai số thô so với công nghệ khác. Kết quả cuối cùng
là trình tự được đọc từng base một với độ chính xác cao, loại bỏ được các lỗi
do đặc thù trình tự, cho phép quá trình giải trình tự mạnh mẽ trên toàn bộ
genome, bao gồm các trình tự lặp lại.
* Phương pháp giải trình tự gen SOLiD[79]
Công nghệ giải trình tự SOLiD được thiết kế dựa trên nguyên lý ghép
nối, toàn bộ genome được cắt thành các đoạn DNA ngắn, sau đó từng đoạn
được gắn với các adapter rồi cố định vào các hạt từ. Quá trình giải trình tự
được thực hiện thông qua các oligonucleotide được đánh dấu huỳnh quang.
Đầu tiên các primer được ghép cặp thông qua liên kết bổ sung với các đoạn
adapter, quá trình tổng hợp được thực hiện như sau: 4 loại oligonucleotide có
đánh dấu huỳnh quang được gắn vào các vị trí tiếp theo bắt đầu từ vị trí 5’P
của mồi. Sau mỗi một lượt gắn của các đoạn oligonucleotide thì một tín hiệu
huỳnh quang được ghi nhận, tiếp đến nhờ hoạt tính của enzyme, các
nucleotide bắt đầu từ số 6 bị loại ra, kèm theo đó nhãn huỳnh quang được loại
bỏ để lộ ra vị trí 5’P, quá trình gắn được tiếp tục thực hiện cho tới hết chiều
dài của đoạn DNA. Kết thúc quá trình thứ nhất, một primer mới tiếp tục được
gắn với sợi khuôn ở vị trí tịnh tiến 1 nucleotide về phía trước so với vị trí
gắn
của primer đầu tiên và tiếp tục quá trình thu nhận tín hiệu thông qua các phản
ứng ghép nối. Quá trình được lặp lại 5 lần, mỗi lần sử dụng một mồi mới và
tịnh tiến 1 nucleotide về phía trước so với vị trí gắn mồi trước đó. Dữ liệu
xuất ra của hệ thống có thể lên tới 60 Gb với khoảng hơn 1 tỷ đoạn được đọc
39
sau mỗi lượt chạy.
* Phương pháp giải trình tự gen SMRT (Single Molecular Real-Time)[79]
SMRT là công nghệ giải trình tự tiên tiến nhất hiện nay. Nếu tất cả các
công nghệ giải trình tự nêu trên đều dựa trên phương pháp cơ bản do Sanger
phát minh ra năm 1977, gọi là “phương pháp gián đoạn chuỗi” (chain-
termination method), thì SMRT xác định trình tự DNA theo một cách hơi
khác: nó “quan sát” quá trình tổng hợp một chuỗi DNA tự nhiên bằng DNA
polymerase đơn lẻ, các tín hiệu từ nucleotide được đánh dấu phosphate sẽ
được phát hiện theo thời gian thực giúp xác định chính xác nucleotide nào
trong 4 loại nucleotide đang được gắn vào mạch, do đó khi đoạn DNA được
sao chép xong thì máy cũng xác định xong trình tự đoạn DNA đó. Công nghệ
này vô cùng hữu ích cho các ứng dụng giải trình tự toàn bộ hệ gen của các
sinh vật chưa có thông tin về hệ gen (de novo genome sequencing).
1.5.2. Phương pháp realtime PCR Taqman Probe [80]
Các phản ứng Real-time PCR Taqman Probe sử dụng những mồi hoặc
mẫu dò đặc hiệu cho từng đột biến hoặc kiểu gen muốn phát hiện. Nếu sử
dụng các chất phát huỳnh quang gắn DNA như SYBR Green thì mỗi phản
ứng chỉ dành riêng cho một đột biến, tức là singleplex. Nếu sử dụng mẫu dò
TaqMan đánh dấu màu huỳnh quang khác nhau, chúng ta có thể phát hiện lên
đến 4-5 đột biến trong cùng 1 phản ứng, sẽ tiết kiệm hóa chất và thời gian. Độ
nhạy kỹ thuật khá cao, có thể phát hiện được đột biến khi tế bào ác tính mang
đột biến ở mức trên 1%. Vì thế phương pháp này không chỉ ít phụ thuộc vào
các nhà giải phẫu bệnh mà còn có thể khoanh vùng các khu vực có tế bào ác
tính và thậm chí có thể áp dụng phát hiện đột biến lưu hành tự do trong máu
ngoại vi, thay vì phải sinh thiết khối u, làm mô bệnh học.
1.5.3. Phương pháp lai phân tử Southern blot
Phương pháp Southern blot được E. Southern phát minh vào năm 1975,
40
cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc
kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào. Để thực hiện
được quá trình lai, đầu tiên, người ta phải tách DNA bộ gen của tế bào. Sử
dụng enzyme cắt giới hạn để cắt phân tử DNA thành những đoạn nhỏ, điện di
trên gel agarose để tách những đoạn có kích thước khác nhau. Gây biến tính
DNA trên gel bằng dung dịch NaOH-0,5M, sau đó, chuyển DNA từ gel sang
màng lai (nitrocellulose). Trong quá trình chuyển, vị trí của DNA phải được
giữ nguyên. DNA cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng
xạ. Sau quá trình lai người ta rửa màng lai để loại bỏ những mẫu dò không bắt
cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng lai.
Kỹ thuật chuyển DNA từ gel agarose lên màng lai cuối cùng, người ta
dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai. Trong kỹ thuật này,
người ta đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai. Các phân tử
lai có đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kết quả được thể hiện qua
các chấm đen trên phim. Ứng dụng quan trọng của Sourthern blot phát hiện
các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen.
1.5.4. Phương pháp hóa mô miễn dịch (HMMD)
1.5.2.1. Nguyên lý kỹ thuật
HMMD là một kỹ thuật nhuộm đặc biệt, sử dụng kháng thể (KT) đặc
hiệu để xác định sự hiện diện của các kháng nguyên (KN) tương ứng trên các
lát cắt mô học hoặc trên các loại tế bào có trong mô [69]. Nguyên tắc: cho KT
đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có KN sẽ có phản ứng kết hợp KN - KT. Có 2
cách quan sát phức hợp này:
+ Miễn dịch huỳnh quang: KT được gắn với một chất phát huỳnh
quang (quan sát kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang).
+ Miễn dịch enzyme: KT được gắn với một vài loại enzyme, enzyme
này xúc tác cho một phản ứng hóa học để chuyển một chất không màu thành
41
một chất có màu (quan sát được dưới kính hiển vi quang học).
Kháng nguyên: các KN thường là các protein, một số khác là
carbohydrate, có thể từ ngoài cơ thể vào (vi khuẩn, độc tố, virus…) hoặc từ
trong cơ thể (các thụ thể hormon, các protein là sản phẩm của đột biến gen…,
có thể hiện diện ở bào tương, màng tế bào hoặc nhân) [81].
Kháng thể: là các globulin miễn dịch nhận biết và kết hợp đặc hiệu với
KN, KT kết hợp trực tiếp với KN gọi là KT thứ nhất.
Hệ thống nhận biết: vì các phức hợp KN - KT không quan sát thấy
được dưới kính hiển vi quang học nên cần một hệ thống để hiển thị vị trí có
phản ứng KN-KT. Hệ thống này gồm 2 phần: KT thứ 2 (KT bắc cầu) và hệ
thống phóng đại dấu hiệu nhận biết (gồm enzyme, các phân tử phát hiện, chất
kết nối và chất màu).
+ Kháng thể thứ hai (KT bắc cầu, KT kết nối): là KT phản ứng đặc hiệu
với KT thứ nhất sau khi KT này đã gắn với KN. KT thứ hai thường được gắn
biotin và được coi như kít phát hiện chung.
+ Các enzyme: enzyme là một protein gây ra sự thay đổi hoá học của
các chất khác nhưng bản thân nó không thay đổi, enzyme đóng vai trò như
chất chỉ điểm. Trong kỹ thuật HMMD, enzyme cần phải đảm bảo được các
điều kiện sau:
- Phải tạo ra một sản phẩm phản ứng mà không thể hoà tan, màu rõ
ràng, kết tủa trực tiếp tại sản phẩm đó.
- Phải được bền vững ở nhiệt độ phòng, có thể sản xuất được nhiều và
có thể duy trì hầu hết các hoạt động của nó sau khi đã kết nối.
Chỉ có một vài loại enzyme đáp ứng được những nhu cầu trên, hai loại
enzyme được sử dụng rộng rãi do sản xuất dễ và giá thành thấp là peroxydase,
được chiết xuất từ rễ cây cải ngựa và phosphatase kiềm (Alkaline
42
phosphatase), chiết xuất từ E. Coli.
+ Các phân tử phát hiện: protein A, biotin và avidin là những phân tử
phát hiện. Sự kết nối hoá học gây nên bởi cầu nối này phải không bị thay đổi
và không bị phá huỷ bởi các hoạt động của enzyme và của kháng thể. Càng
giữ cho hoạt động sinh học của các thành phần này tốt thì quá trình kết nối
càng được thực hiện tốt.
+ Chất tạo hợp chất màu: dùng để tạo ra một sản màu tại vị trí kết hợp
KN-KT mà có thể quan sát được trên kính hiển vi quang học. Phản ứng này
cũng để chứng minh sự có mặt của enzyme. Hiện nay, các phòng xét nghiệm
HMMD thường sử dụng diaminobenzidine (DAB), loại này tạo ra một sản
phẩm màu nâu, bền vững trong nhiều năm [81].
1.5.1.2. Các kỹ thuật nhuộm miễn dịch enzyme [81]
Hình 1.11. Sơ đồ phƣơng pháp hóa mô miễn dịch
với phức hợp Avidin - Biotin
+ Miễn dịch enzyme trực tiếp: KN mô kết hợp với KT thứ nhất có gắn
enzyme, phương pháp này đơn giản, nhanh, có tính đặc hiệu nhưng ít nhạy do
K
K
T
T
2
2
g
g
¾
¾
n
n
b
b
i
i
o
o
t
t
i
i
n
n
KT 1
K
K
N
N
B
B
i
i
o
o
t
t
i
i
n
n
A
A
v
v
i
i
d
d
i
i
n
n
E
E
n
n
z
z
y
y
m
m
e
e
B
B
Ö
Ö
n
n
h
h
p
p
h
h
È
È
m
m
c
c
è
è
®
®
Þ
Þ
n
n
h
h
f
f
o
o
c
c
m
m
o
o
n
n
43
thiếu hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết.
+ Miễn dịch enzyme gián tiếp (phương pháp cầu nối): gồm KN mô +
KT thứ nhất + KT thứ hai (kháng Ig loài của KT thứ nhất) gắn với hệ thống
phóng đại dấu hiệu nhận biết.
Hiện nay có nhiều phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch, các phương
pháp thường dùng là:
+ Phương pháp enzyme chống enzyme (Peroxydase-antiperoxydase):
KN mô + KT thứ nhất + KT thứ hai gắn phức hợp enzyme chống enzyme
(peroxydase- antiperoxydase).
+ Phương pháp cầu nối Avidin - Biotin (Avidin - Biotin conjugate),
(phương pháp ABC): KN mô + KT thứ nhất + KT thứ hai gắn phức hợp
Avidin, Biotin và peroxydase.
+ Phương pháp cầu nối Biotin - streptavidin: KN mô + KT thứ nhất +
KT thứ hai gắn phức hợp Biotin, Streptavidin và peroxydase.
+ Phương pháp phosphatase kiềm - kháng phosphatase kiềm (Alkaline
phosphatase - antialkaline phosphatase) (phương pháp APAAP).
Thực tế cho thấy rằng với những u đặc thì nhuộm bằng phương pháp ABC có
độ nhạy cao hơn, ít gây nhuộm nền hơn so với các phương pháp khác [81].
44
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là những bệnh nhân vào viện, đã được chẩn đoán
xác định là ung thư da bằng mô bệnh học tại Bệnh viện da liễu Trung ương.
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
- Bệnh nhân được chẩn đoán xác định là ung thư da các thể tế bào đáy, tế bào
vảy và tế bào hắc tố bằng xét nghiệm mô bệnh học.
- Có đầy đủ các khối nến chứa bệnh phẩm đủ để làm xét nghiệm giải trình tự
gen và xét nghiệm hoá mô miễn dịch.
- Có đầy đủ hồ sơ lưu trữ.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Bệnh nhân bị ung thư khác ở da hoặc ung thư từ các cơ quan khác di căn đến
da.
- Các ung thư da tái phát, đã được điều trị hoá chất và tia xạ tiền phẫu.
- Những bệnh nhân mắc 2 ung thư trở lên.
- Những bệnh nhân không có đầy đủ hồ sơ bệnh án lưu trữ.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang
Tính cỡ mẫu theo công thức cỡ mẫu cho nghiên cứu mô tả
2
2
)2/1(
)1(
d
ppx
zn
Trong đó:
45
- z
(1-/2)
= 1,96 với = 0,05
- d = 0,15 Sai số về tỷ lệ của quần thể nghiên cứu
- p = 0,392 lấy theo kết quả nghiên cứu trước đây về tỷ lệ đột biến gen
BRAF trong ung thư da [35]: n = 40,7
- p = 0,244 lấy theo nghiên cứu về tỷ lệ đột biến gen TP53 trong ung
thư da [16]: n = 31,5
Nghiên cứu của chúng tôi, n = 63 mẫu ung thư da gồm 03 thể chính:
+ 21 mẫu ung thư tế bào đáy
+ 21 mẫu ung thư tế bào vảy
+ 21 mẫu ung thư tế bào hắc tố
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Xác định các đột biến của gen P53 và BRAF ở mô ung thư da, các kỹ
thuật sau được sử dụng:
- Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số.
- Kỹ thuật PCR.
- Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm PCR.
- Kỹ thuật sequencing.
2.2.2.2. Xác định biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thư da, sử dụng
kỹ thuật: Hóa mô miễn dịch
2.2.2.3. Xác định mối tương quan giữa đột biến gen TP53 và biểu lộ protein
p53 đột biến ở mô ung thư da.
2.2.3. Các qui trình và kỹ thuật nghiên cứu
2.2.3.1. Qui trình kỹ thuật tách chiết DNA tổng số từ mô ung thư
- Mô ung thư được nghiền trong 1ml isogen bằng cối nghiền đồng thể, sau đó
chuyển sang ống Eppendorf 1.5 ml.
46
- Thêm 0,2 ml chloroform vào dung dịch. Giữ ở nhiệt độ phòng 2-3 phút.
- Ly tâm với tốc độ 15.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4
o
C.
- Hút lớp dịch trên cùng có chứa DNA.
- Thêm 0,5 ml dịch ethanol lạnh và giữ ở nhiệt độ phòng 10-15 phút.
- Ly tâm với tốc độ 15000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4
o
C.
- Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cặn màu trắng đục. Đây chính là cặn DNA thu
được.
- Thêm ít nhất 1 ml ethanol 70% ống Eppendorf có chứa cặn, dùng tay lộn
ngược ống Eppendorf vài lần để rửa cặn.
- Ly tâm với tốc độ 15000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4
o
C.
- Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cặn DNA.
- Giữ khoảng 1 phút để thu cặn DNA. Lưu ý là không để cặn khô quá để tránh
làm giảm chất lượng DNA và cặn sẽ khó được hòa tan.
- Hòa tan cặn trong nước khử ion
- Bảo quản dịch DNA ở -70
o
C.
2.2.3.2. Xác định nồng độ, độ sạch DNA bằng phương pháp quang phổ kế
Nguyên lý của phương pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử
ngoại ở bước sóng 260nm của các base. Giá trị mật độ quang ở bước sóng
260nm (OD260nm: Optical Dencity260nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng
độ nucleic dựa vào tương quan sau:
Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ là:
- 50µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi.
- 40µg/ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn.
Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta cho thêm giá trị OD ở
280nm (OD280nm). Các protein có mức hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280nm,
47
nhưng cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các acid nucleic. Do đó
làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleic. Một dung dịch acid nucleic
đạt tiêu chuẩn về độ sạch (không nhiễm protein) khi tỷ số OD260nm/OD280nm nằm
trong khoảng 1,8 - 2,0.
Dựa vào nguyên lý trên, tất cả các mẫu DNA tách chiết đều được đo
bằng phương pháp quang phổ để xác định nồng độ và độ tinh sạch, chỉ những
mẫu nào đạt nồng độ tối ưu và độ tinh sạch dao động từ 1,8-2,0 mới được sử
dụng vào phản ứng PCR.
Sử dụng máy quang phổ Nanodrop 2000 để đo nồng độ và tính toán độ
tinh sạch của DNA tách được (hình 2.1).
+ Chọn bước sóng 260nm, là bước sóng hấp thụ cực đại của acid nucleic.
+ Nhỏ 2µl dung dịch TE hoặc nước cất lên đầu đo cảm ứng (chứng
blank).
+ Lau khô bề mặt đầu đo cảm ứng bằng giấy thấm.
+ Lấy 2µl dung dịch DNA/1 mẫu để đo.
+ Kết quả: kết quả đo được kết nối với hệ thống máy vi tính thể hiện
bằng đồ thị độ hấp thụ và các thông số ở các bước sóng 260nm, 280nm.
Hình 2.1. Máy đo quang phổ Nanodrop 2000