Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thư da và mối liên quan của nó với các thể bệnh

28 (n=95) và sự biểu lộ này tăng dần theo độ mô học [46]. Trong ung thư da, đã có một số nghiên cứu đi sâu vào cơ chế phân tử nói chung và đột biến gen TP53, nhưng chưa có nghiên cứu nào xác định sự biểu lộ của protein đột biến này ở mô ung thư. Việc tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gen TP53 và sự biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thư là cần thiết, kết quả đó sẽ giúp các nhà lâm sàng có thể xác định đột biến gen TP53 phức tạp bằng kỹ thuật đơn giản hơn. Đó là kỹ thuật xác định sự biểu lộ protein p53 đột biến bằng phương pháp hóa mô miễn dịch, đây cũng là xét nghiệm dễ làm hơn và cho phép phát hiện sự tích luỹ bất thường của protein p53 trong tế bào ung thư. Kích thích hoạt tính các gen ức chế ung thư khác, được coi là gen đích của gen TP53. 1.4. GEN BRAF VÀ UNG THƢ DA 1.4.1. Cấu trúc gen BRAF Gen BRAF gồm 18 exon có 208.816 bp nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 7 vị trí 7q34 [52]. Gen BRAF gồm 18 exon có 208.816 bp nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 7q34. Hình 1.8. Vị trí gen BRAF trên nhiễm sắc thể số 7 [52].

29 Gen BRAF được xem như là một gen tiền ung thư, gen mã hóa thông tin cho protein BRAF có trọng lượng phân tử 94 kDa là chất có hoạt tính kinase với chức năng truyền tín hiệu nội bào xuôi dòng phía dưới protein KRAS của con đường tín hiệu RAS-MAPK [48]. Protein BRAF tương tác đặc hiệu với Serine/ Threonine điều hòa thông qua các tín hiệu dẫn truyền. Nó bao gồm 3 vùng bảo thủ đặc trưng của họ Raf-kinase: vùng tự điều hòa CR1- vị trí liên kết giữa Ras với GTP, vùng giàu Serine CR2, vùng (chức năng) xúc tác CR3-photphoryl trình tự đặc hiệu trên protein cơ chất. Khi hoạt động chức năng/ ở trạng thái hoạt hóa, BRAF tạo ra các dimer bằng liên kết hidro và tương tác tĩnh điện giữa các miền kinase của nó. 1.4.2. Gen BRAF và con đường tín hiệu sinh ung thư Sự phát triển, biệt hóa và sống còn của tế bào bình thường được điều hòa bởi một số lượng giới hạn các con đường tín hiệu. Các con đường tín hiệu truyền và kết hợp các tín hiệu từ ngoại bào như: các yếu tố phát triển, hormon, các liên kết tế bào - tế bào, tế bào - khoảng gian bào thông qua các thụ thể trên màng tế bào đi vào bên trong tế bào, rồi tiếp tục qua các protein dẫn truyền trong bào tương để đi vào nhân tế bào. Ở trong tế bào các tín hiệu này sẽ hoạt hóa các gen sao chép dẫn đến sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Các loại protein tín hiệu, protein màng, protein bào tương và protein nhân liên quan đến tăng sinh, biệt hóa tế bào đều là sản phẩm của c-oncogen (proto-oncogen) trong điều kiện bình thường. Khi có sự mất điều hòa hoạt động của chúng, các c-oncogen đột biến trở thành oncogen có thể xuất hiện ung thư và trong tình huống này con đường tín hiệu sẽ trở thành “con đường tín hiệu sinh ung thư”. Sự mất cân bằng giữa oncogen và gen ức chế ung thư, sự hoạt động không phù hợp hoặc sự bất hoạt của các con đường tín hiệu là yếu tố quyết định đối với sự phát triển ung thư ở người. Nhiều gen sinh ung thư và nhiều gen ức chế ung thư cũng hoạt động trong khuôn khổ “con đường tín hiệu sinh

30 ung thư” này [53],[54]. Các con đường tín hiệu có thể được khái quát như sau: - Các tín hiệu ngoại bào (GF, cytokine, hormon…). - Các tín hiệu ở màng tế bào (thụ thể màng tế bào). - Các tín hiệu ở bào tương (RAS, RAF, ERK, của con đường MAPK...). - Các tín hiệu trong nhân tế bào (Jun, Myc...). Trong khuôn khổ của đề tài này chúng tôi chỉ đề cập đến yếu tố RAF do gen BRAF mã hóa tham gia vào con đường tín hiệu MAPK. 1.4.2.1. Quá trình hoạt động của con đường tín hiệu MAPK Con đường dẫn truyền tín hiệu RAF-MEK-ERK là dòng thác protein kinase được hoạt hóa bởi RAS. Con đường này điều hòa sự phát triển, tăng sinh và biệt hóa tế bào đáp ứng với những kích thích từ các yếu tố phát triển, kháng thể, cytokine và hormone… [55]. Qua con đường này, RAS được cho là để thúc đẩy sự thay đổi về khung và hình dạng tế bào, sự kết dính và di chuyển tế bào. Điều đó được thể hiện phổ biến ở các tế bào với RAS sinh ung thư [56],[57],[58]. Sự biến đổi RAS trong ung thư là do chức năng điều hòa nút của nó ở một số con đường liên quan với các đặc tính thiết yếu của tế bào ung thư. Trong số các tác dụng khác nhau này sự hoạt hóa con đường ERK MPK là quyết định nhất đối với sự kích thích tăng sinh tế bào ung thư cùng với sự biến đổi về RAS. Một trong các lý luận của nguyên lý này chính là sự biến đổi loại trừ lẫn nhau của gen RAS và BRAF trong một số ung thư, nổi bật là trong u hắc tố [59]. Trong hoạt tính chuyển dạng của gen ung thư nguồn gốc virus (v- oncogen) thì RAS và RAF là các yếu tố được đề cập đến nhiều trong các nghiên cứu và chính RAF là yếu tố hiệu ứng đầu tiên được xác định của dòng tín hiệu được hoạt hóa từ RAS [60],[61],[62],[63]. Hoạt hóa RAF được khởi đầu bởi sự kết hợp RAS-GTP với vùng gắn

31 RAS (RBD: RAS binding domain) nằm trong khu vực điều hòa N tận của kinase. Sự thay đổi thích ứng và sự kết hợp lên màng tế bào làm khởi động quá trình phosphory1 hóa RAF, điều đó kết hợp với việc kích thích hoạt tính serine/threonine/kinase của RAF gây phosphoryl hóa liên tục và gây hoạt hóa MEK và ERK [62],[63]. Ba protein RAF có chức năng ở người là ARAF, BRAF và CRAF hoạt động phụ thuộc vào sự phosphory1 hóa của đoạn mang hoạt tính [64]. Mối thông tin liên lạc giữa RAF, MEK và ERK cần có protein kết nối, đó là một đồng dạng của RAF không có hoạt tính kinase [61]. MAPK tạo tín hiệu qua bào tương vào nhân và nhân kích thích các yếu tố điều khiển các tế bào ở trạng thái nghỉ trở thành tế bào ở trạng thái phân bào. Trong nhân tế bào, hai phân tử rất quan trọng để điều khiển sự phát triển tế bào qua các giai đoạn phân chia tế bào là các cyclin và các enzyme hoạt hóa phụ thuộc cyclin (CDKS: Cyclin Dependent Kinases). Nếu không có các cyclin thì các CDKS không hoạt động được. Tuy nhiên, cần phải có các CDKS thì các cyclin mới làm cho các tế bào từ trạng thái nghỉ trở nên hoạt động và vì thế hoạt hóa quá trình phân chia tế bào. Một trong những cyclin rất quan trọng này là cyclin D. Nó đóng vai trò quan trọng đặc biệt trong tiến trình phân chia tế bào [65]. Sự kết hợp của cyclin D hình thành bước cuối cùng trong con đường liên kết hoạt hóa thụ thể yếu tố phát triển biểu mô và phân chia tế bào. Khi MAPK đi vào trong nhân tế bào, nó gây kết hợp cyclin D và tác động lên “chất kìm hãm sinh học” và khi sự kìm hãm sinh học bị bất hoạt thì tế bào buộc phải vận chuyển sang trạng thái phân chia hoạt động [66]. 1.4.2.2. Vai trò con đường tín hiệu MAPK trong ung thư Sự hoạt hóa liên tục của con đường tín hiệu RAS-MEK-ERK là phổ biến với nhiều loại ung thư. Xấp xỉ 15% ung thư ở người có sự biến đổi hoạt động của RAS và biến đổi BRAF gần đây được xác định qua sàng lọc trên phạm vi rộng của gen đột biến trong ung thư ở người [67],[68],[69]. Đột biến của BRAF liên quan đến 60% các khối u hắc tố ác tính và xảy ra với tần suất

32 YÕu tè ph¸t triÓn Thô thÓ yÕu tè ph¸t triÓn PI3-K RAS JAK RAF PKD1 MEK ATK/PKB ERK STAT Mµng tÕ bµo từ vừa đến cao ở ung thư biểu mô đại trực tràng, ung thư biểu mô buồng trứng [70], ung thư phổi và ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú [71]. Điều đó có gợi ý rằng việc hoạt hóa biến đổi gen sinh ung thư BRAF như là yếu tố khởi động chủ chốt của khối u ác tính. Sự biến đổi BRAF và RAS được giới hạn một cách có ý nghĩa với các loại u tương tự và thông thường là theo cách loại trừ lẫn nhau. Điều này cho phép các tác giả nghĩ rằng các gen này cùng trên một con đường tín hiệu sinh ung thư với nhau; đồng thời cũng gợi ý rằng RAS tác động gây hoạt hóa BRAF ở các loại hình ung thư này [72]. Hình 1.9. Con đƣờng tín hiệu MAPK [66] Sự hoạt hóa con đường JNK MAPK (JNK: Jun kinase N tận - một con đường thành viên khác trong con đường tín hiệu MAPK) bởi RAS là một khía cạnh khác trong chức năng đa chiều của protein này. Sự tăng cường hoạt hóa của protein RAS ở tế bào bình thường có thể gây ngừng phát triển, chết theo Gen sinh u nh- JUN, FOS Sao chÐp gen

33 chương trình hoặc suy yếu sự sao chép tế bào. Ở một số loại tế bào, sự hoạt hóa RAS cũng có thể gây biệt hóa tế bào. Chính vì thế, ngoài tác dụng tăng sinh tế bào, các protein RAS ở trạng thái hoạt hóa còn kích thích các đáp ứng khác, thậm chí cả việc chấm dứt tác dụng của chúng. Trong một vài trường hợp, nó còn tạo ra phản ứng bảo đảm an toàn chống lại sự tăng sinh quá mức. Tùy theo tình huống mà con đường JNK MAPK có thể hoạt động theo cách thức này [66],[67]. Như vậy khi các thụ thể yếu tố phát triển trên màng tế bào được hoạt hoá thì các protein RAS, RAF sẽ hoạt hóa hầu như liên tục, chúng làm trung gian cho nhiều hiệu ứng của hoạt động sinh lý hoặc là hoạt động sinh ung thư của các thụ thể tyrosin kinase (RTK), đặc biệt là hoạt động của con đường MAPK theo chiều của protein RAS, RAF. Thực vậy, protein RAS, RAF làm trung gian không những cho các tín hiệu qua thụ thể tyrosin kinase mà còn liên quan đến việc đáp ứng của tế bào với các cytokin và hormon. Ngược lại thụ thể tyrosin kinase và các yếu tố khác điều chỉnh hoạt động của MAPK và các con đường ung thư khác nữa không chỉ thông qua RAS, RAF mà còn qua nhiều cơ chế khác nhau [72],[73]. 1.4.2.3. Đột biến gen BRAF trong ung thư da Yếu tố tín hiệu RAF thuộc con đường tín hiệu MAPK có ba đồng dạng là ARAF, BRAF và CRAF. Đồng dạng CRAF biểu lộ khắp nơi trong khi BRAF biểu lộ ở mức cao hơn trong tế bào máu, thần kinh và tinh hoàn [74],[75], BRAF là đồng dạng nổi trội ở tế bào da. Mặc dù tất cả các đồng dạng RAF đều hoạt hoá MEK nhưng chúng được hoạt hoá một cách khác nhau bởi RAS [76],[77]. Theo Peyssonnaux C. và cs thì BRAF có ái tính cao hơn với MEK1 và MEK2 và có nhiều khả năng phosphoryl hóa MEK hơn các đồng dạng RAF khác [57]. Theo Paul T.C. và cs đã khám phá rằng biến đổi hoạt tính gen sinh ung thư BRAF xảy ra ở 2/3 các u hắc tố ác tính và ở tần suất cao trong các ung thư khác [36].

34 Đột biến gen BRAF trong ung thư nói chung và ung thư da nói riêng thường xảy ra ở vị trí: A1023G (P341P); A1227G (S409S); T1799A (V600E); A1383G (Q461Q); A1797C (T599T); A1929G (G643G); G2272A (G758R). Trong đó vị trí 1799 TA làm thay thế Valine bằng Glutamate của chuỗi acid amin (V600E) chiếm khoảng 80 - 90%. 70% đột biến gen BRAF được tìm thấy ở những bệnh nhân ung thư da [72]. Sự thay đổi này dẫn đến con đường tín hiệu MAPK bị kích hoạt liên tục, và không đáp ứng với sự kiểm soát thông thường. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng tập trung nghiên cứu đột biến gen BRAF (V600E), là đột biến xảy ra với tần suất cao trong mô ung thư da. Sự biến đổi gen BRAF có thể minh chứng rằng BRAF là dấu ấn quan trọng của kiểu hình lâm sàng và mô bệnh học của ung thư da, đặc biệt là ung thư tế bào hắc tố, nó trở thành một dấu ấn chẩn đoán và tiên lượng có giá trị, dựa vào việc sử dụng các chất ức chế protein BRAF [72],[74]. Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc xác định đột biến của gen BRAF ở bệnh nhân ung thư da tại Việt Nam, từ đó giúp các bác sỹ lâm sàng lựa chon phương pháp điều trị bổ trợ thích hợp cho các bệnh nhân ưng thư da, nhằm cải thiện thời gian sống thêm của bệnh nhân. 1.5. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN TP53 VÀ GEN BRAF 1.5.1. Phương pháp giải trình tự gen 1.5.1.1. Phương pháp giải trình tự gen Sanger Giải trình tự của gen là xác định được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide trên phân tử DNA của đoạn gen đó. Hiện nay, trong lĩnh vực sinh học nói chung và sinh học phân tử nói riêng thì việc giải trình tự nucleotide của một đoạn gen được ứng dụng nhiều trong việc xác định các gen, các alen, các đột biến gen. Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh như [78]: - Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học của Alan

35 thêm dNTP, DNApolym erase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP CATACGTGG CCTTACG GGAATGC Chiều điện di * CGTAAGGCCACGTA TdG * CGTAAGGCCACGTAdT * CGTAAGGCCACGTdA * CGTAAGGCCACGdT * CGTAAGGCCACdG * CGTAAGGCCAdC * CGTAAGGCCdA * CGTAAGGCdC * CGTAAGGdC CGTAAGGCCdA CGTAAGGCdC CGTAAGGCCACdG CGTAAGGCCACGTdA CGTAAGGdC CGTAAGGCCACGTA TdG CGTAAGGCCAdC CGTAAGGCCACGdT CGTAAGGCCACGTAdT Maxam và Walter Gilbert. - Phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme hay phương pháp Dideoxy của Frederick Sanger. Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển y sinh học hiện đại. Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gen tự động đều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger. Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn được sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Các ddNTP đánh dấu hùynh quang khác nhau, tương ứng với nuleotide tận là A, T, C và G. Hình 1.10. Nguyên lý giải trình tự gen trên máy giải trình tự gen tự động

36 Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA. Sau khi đã xác định được trình tự của gen, so sánh trình tự thu được và trình tự gốc của gen đó trên genebank bằng phần mềm để phát hiện các đột biến ở các gen. Phương pháp giải trình tự gen này cho phép xác định trình tự các nucleotid chính xác tới 99%, tuy nhiên để ứng dụng xác định các đột biến các gen liên quan trong ung thư thì độ nhạy còn thấp vì phương pháp đòi hỏi lấy được vùng có từ 15-20% tế bào ung thư trở lên. Khi thực hiện phương pháp này để xác định các đột biến gen trong ung thư thông thường phải phối hợp với phương pháp nhuộm Hematoxylin để xác định và đánh dấu vùng có chứa nhiều tế bào ung thư. 1.5.1.2. Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới NGS (Next Generation Sequencing) [79] Công nghệ giải trình tự thế hệ mới NGS đã có mặt và phát triển trong những năm gần đây. Với ưu thế thời gian đọc nhanh, chính xác các công nghệ NGS được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, từ nghiên cứu cơ bản cho đến các nghiên cứu về chẩn đoán lâm sàng, hệ gen học trong nông nghiệp và khoa học hình sự... Các phương pháp giải trình tự này có ưu điểm thực hiện được hàng ngàn cho tới hàng triệu phản ứng giải trình tự cùng lúc, kết quả giải trình tự được xác định trực tiếp không cần thông qua điện di.

37 * Phương pháp giải trình tự gen pyrosequencing 454[79] Pyrosequencing 454 do 2 nhà khoa học Nyren và Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm, Thụy Điển phát minh, và được phát triển bởi Công ty 454 Life Science, là một hệ thống giải trình tự DNA 2 bước có độ tương đồng cao với dung lượng lớn hơn rất nhiều so với hệ thống giải trình tự Sanger. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý “giải trình tự bằng tổng hợp” bao gồm khởi động một sợi DNA đã được giải trình tự và giải trình tự sợi bổ sung bằng phản ứng của enzyme. Đây là hệ thống có thể khuếch đại một số lượng lớn các đoạn DNA trong các giếng picotiter. Nguyên lý “giải trình tự bằng việc tổng hợp” cũng dựa trên việc nhận biết các pyrophosphate được giải phóng trong quá trình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide. Công nghệ pyrosequencing có tính linh hoạt cao khi liên kết cặp primer, có khả năng phân tích được nhiều đột biến, dữ liệu và thông tin trình tự tập hợp được đầy đủ. Kỹ thuật này có tính nhạy cao hơn hẳn so với phương pháp truyền thống, độ chính xác lên tới 99,9% với các đoạn 200 base và 99% với các đoạn 400 base. Hệ thống giải trình tự được 400-600 triệu bp trong vòng 10 giờ, giúp giảm giá thành đáng kể so với khi sử dụng phương pháp Sanger để giải trình tự một số lượng lớn DNA. Công nghệ này cùng với các kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới khác có nhiều ảnh hưởng đến hoạt động nghiên cứu có lượng dữ liệu đầu vào lớn, và yêu cầu xử lý trong thời gian ngắn, nhờ đó đã tạo ra nhiều đột phá trong các lĩnh vực: công nghệ sinh học, sinh học pháp y, hệ thống học và y học. * Phương pháp giải trình tự gen SBS (sequencing by synthesis)[79] Công nghệ giải trình tự bằng tổng hợp SBS sử dụng 4 nucleotide đánh dấu huỳnh quang để giải trình tự hàng chục triệu cluster đồng thời trên bề mặt flow-cell. Trong mỗi chu trình giải trình tự, một deoxynucloside triphosphate đánh dấu (dNTP) được thêm vào chuỗi acid nucleic. Nhãn huỳnh quang của