Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thư da và mối liên quan của nó với các thể bệnh

18 Trong một số ung thư khác, bất thường DNA biểu hiện ở dạng rối loạn NST (NST bị đứt gẫy, lệch bội), ví dụ trong hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi, Atasia- telangiectasia, lơ xê mi, nhiều NST bị đứt gẫy. Bảng 1.2. Một số gen ức chế khối u [37] Tên gen Vị trí trên NST Bệnh do đột biến ở dòng tế bào sinh dục Rb-1 (Retinoblastoma) APC (Adenomatous polyposis coli) NF1 NF2 (Neurofibromatosis) TP53 P16 BRCA1 BRCA2 13q14 5q21 17q11 22q12 17p13 9q21 17q21 13q12 Ung thư võng mạc Ung thư xương Polyp gia đình U xơ thần kinh I U xơ thần kinh II H/chứng Li- Fraumeni Ung thư da gia đình Ung thư vú, ung thư buồng trứng gia đình Ung thư vú gia đình 1.2.2.5. Đột biến nhiễm sắc thể gây ung thư Ngày nay bằng kỹ thuật hiện đại, người ta thấy nhiều bất thường DNA đặc trưng trong lơ xê mi là do bất thường NST tạo gen lai như gen lai ABL/BCR trong lơ xê mi kinh là do chuyển đoạn NST 9 và NST 22. Gen lai AMLI/ETO trong lơ xê mi cấp là do chuyển đoạn NST 8 và NST 21. Các gen lai này tạo sản phẩm protein lai đột biến có tác động kích hoạt phân bào mạnh mẽ gây lơ xê mi. Một số bệnh có NST không bền vững như hội chứng Fanconi, hội chứng Bloom có tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cao hơn người bình thường nhiều lần. Có những nghiên cứu còn cho thấy, ngoài lơ xê mi, những bệnh nhân bị

19 hội chứng Fanconi còn dễ mắc ung thư phổi. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy tia xạ gây đứt gẫy NST, đồng thời nhiều thông báo cũng khẳng định tia xạ có vai trò gây lơ xê mi. Những người điều trị bằng tia xạ hay bị nhiễm xạ có tỷ lệ bị bệnh ác tính cao. Một số dạng đột biến NST nêu trên đã tạo điều kiện cho các proto- oncogen trở thành dạng oncogen có tính chất gây ung thư. Các đột biến NST về số lượng thường gây mất cân bằng gen (tăng gen sinh u) còn các đột biến cấu trúc NST có thể làm biển đổi đến cấu trúc của các gen tiền sinh u hoặc gen ức chế khối u tạo gen đột biến hoặc gen lai gây tăng sinh hỗn loạn gây u. 1.2.2.6. Ung thư phát sinh do sự tương tác của môi trường và di truyền Có nhiều dạng ung thư phát sinh có thể được giải thích bằng sự tương tác của di truyền và môi trường, bệnh ung thư vú là một ví dụ. Người ta thấy tỷ lệ mắc ung thư vú có mối liên quan với mọi người trong họ hàng, đồng thời liên quan với sự mãn kinh, với nội tiết tố sinh dục. 1.3. GEN TP53 VÀ UNG THƢ DA 1.3.1. Cấu trúc và sản phẩm của gen TP53 Gen TP53 nằm trên nhánh ngắn của NST số 17 (17p13.1), gen TP53 có kích thước 22.000bp, gồm 11 exon [38]. Hình 1.4. Sơ đồ vị trí, cấu trúc gen TP53 và sơ đồ protein p53

20 Gen TP53 còn được gọi là gen ức chế khối u được phát hiện từ năm 1979, nó nằm trên nhánh ngắn thuộc vùng 1, băng 3 băng phụ 1 của NST số 17 (17p13.1). Gen TP53 có kích thước 22.000bp, gồm 11 exon mã hóa cho protein p53 có trọng lượng phân tử 53kDa. Bình thường gen TP53 ở trạng thái không hoạt động. Gen TP53 được hoạt động khi có sự sai lệch về vật chất di truyền nhằm [38],[39],[40]: - Chống tăng sinh tế bào, chống tế bào chuyển ác tính bằng kiểm soát chu kì tế bào, cảm ứng quá trình chết theo chương trình (apoptosis), có tác dụng sửa chữa các tổn thương DNA, ngăn cản sự xuất hiện đột biến của tế bào. - Kích thích hoạt tính các gen ức chế ung thư khác, được coi là gen đích của gen TP53. Sản phẩm protein p53 được chọn là phân tử của năm 1993, là chìa khóa di truyền của sự phát triển ung thư. Protein p53 có khả năng hạn chế các đột biến xảy ra ở tế bào thông qua tác dụng của nó trên chu kỳ tế bào. Cơ chế tác dụng của protein p53 trên chu kỳ tế bào là ức chế chu kỳ tế bào và làm ngừng chu kỳ ở các giai đoạn chuẩn bị G1 chuyển sang S và ở giai đoạn G2 chuyển sang M. Sự kiểm soát chu kỳ tế bào do các protein - kinase đảm nhiệm, đó là các protein - kinase phụ thuộc cyclin, viết tắt là CDK. Cyclin là các protein chi phối hoạt tính của các CDK. Để tế bào đi từ một pha này sang một pha khác tiếp theo thì một CDK nhất thiết phải phối hợp với một cyclin. Muốn chuyển G1 sang S cần phải có phức hợp cyclin E - CDK2, muốn chuyển pha G2 sang M cần có phức hợp cyclin B - CDK1. Các phức hợp bị ức chế bởi các protein p21, sự tổng hợp protein p21 phụ thuộc vào protein p53 gắn vào promoter và khởi động gen đó. Do vậy protein p53 ức chế chu kỳ tế bào thông qua sản phẩm của gen p21 và một số sản phẩm của gen khác là gen đích của gen TP53 [29],[38],[39].

21 Hình 1.5. Vai trò của gen TP53 trong chu kỳ tế bào Các thời gian dừng chu kỳ tế bào này là để sửa chữa các tổn thương DNA do các yếu tố vật lý, hóa học, sinh học... gây ra, làm cho tế bào không bị đột biến và được sống sót, không bị tiến triển thành ác tính. Khi tế bào dừng ở giai đoạn G1 sẽ tránh được sự nhân đôi DNA tổn thương, dừng ở G2 tránh được việc duy trì các tế bào có các DNA hư hại không được sửa chữa mà bước ngay vào quá trình phân bào. Gen TP53 tham gia vào quá trình sửa chữa này bằng cách tăng phiên mã để tổng hợp một số protein có chức năng sửa chữa DNA. Nếu DNA bị tổn thương sửa chữa được thì tế bào được phép thực hiện nốt chu trình của mình. Nhưng vì một số nguyên nhân nào đó mà cơ chế sửa chữa không thành công, thì gen TP53 sẽ dừng quá trình phân chia của các tế bào đột biến và khởi động quá trình chết theo chương trình (apoptosis). TP53 Mdm2 p53 p21 CDK2 Cyclin E G1 S G2 M X CDK1 Cyclin B X p53 CBP TRAF P300 PCAF ASPP1 p53 ho¹t ho¸

22 Như vậy khi một tế bào bị tổn thương DNA nếu không sửa chữa được, thì protein p53 sẽ tác động trực tiếp để đưa tế bào vào giai đoạn chết theo chương trình. Với những chức năng này, gen TP53 được gọi là “người bảo vệ bộ gen” [29]. Protein p53 cảm ứng cho quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis): quá trình chết tế bào theo chương trình là hiện tượng quan trọng trong các cơ quan, giữ gìn hằng định số lượng tế bào và giúp phá hủy các tế bào có khả năng gây phản ứng tự miễn. Như vậy, khi thiếu protein p53 hoặc protein p53 bị biến đổi thì hiện tượng chết theo chương trình sẽ giảm, lúc này tế bào có đột biến cũng không chết và hiện tượng tăng phân bào tiếp tục xảy ra đó là cơ chế duy trì các tế bào có đột biến, khi tích lũy thêm các đột biến ở mức độ nhất định sẽ hình thành các tế bào ung thư (có đột biến). Đặc biệt khi cả 2 alen từ bố và mẹ của gen TP53 bị tổn thương thì sự ức chế tế bào chết theo chương trình càng xảy ra dễ dàng hơn khi chỉ bị tổn thương 1 alen, lúc này tế bào không chết mà cứ tăng phân bào. Đột biến gen TP53 là biến đổi di truyền hay gặp trong nhiều loại ung thư ở người, đặc biệt là các loại ung thư như ung thư da, phổi, vú và đại tràng... Các đột biến gen TP53 hầu hết là đột biến điểm hay gặp ở đoạn exon 5 đến 9, kết quả làm cho protein sản phẩm mất chức năng nhưng nó lại trở nên bền vững hơn và gây tích tụ với một nồng độ cao trong nhân tế bào, tạo ra các sản phẩm gọi là protein p53 đột biến. Trong ung thư da, đột biến thường xảy ra ở exon 5,7 trên các vị trí sau: 175, 177, 248, 282 [40],[41]. Protein p53 làm tăng tính nhạy cảm với xạ trị và có thể cả với hóa trị liệu. Khi thiếu protein p53 hoặc p53 bị đột biến mất chức năng, tế bào sẽ kém nhạy cảm với xạ trị . * Các loại tổn thương, đột biến hay mất chức năng của gen TP53 [42]: Hoạt tính gen TP53 được thể hiện chức năng của phân tử protein p53

23 trong dịch sinh học và ở các mô. Các tổn thương gen TP53 có thể gặp: + Đột biến điểm: do chuyển đổi vị trí pyrimidin này bằng pyrimidin khác, hoặc cặp pyrimidin này bằng cặp pyrimidin khác. + Đột biến mất đoạn: do mất các vùng trên nhiễm sắc thể làm bất hoạt, mất gen TP53. Điển hình là mất tính dị hợp tử (LOH: loss of heterozygosity) do mất đoạn nhiễm sắc thể chứa gen TP53 ở một trong hai NST tương đồng gây ra mất một trong hai alen của tế bào. Tuy nhiên, trong ung thư tế bào đáy thì tần suất mất tính dị hợp tử thấp hơn so với các ung thư khác [43],[44]. 1.3.2. Vai trò của gen TP53 trong cơ chế bệnh sinh ung thư da Quá trình chết tế bào theo chương trình là tiến trình thầm lặng và còn chưa biết đầy đủ. Chết tế bào theo chương trình là một hiện tượng cơ bản của sự sống ở cơ thể đa bào. Nó liên quan đến quá trình phát triển của phôi và liên quan đến khả năng giữ hằng định nội môi của cơ thể trưởng thành (cân bằng giữa tái sinh, tăng sinh và chết) đặc biệt đối với các tổ chức thường xuyên đổi mới như hệ thống miễn dịch. Quá trình chết tế bào theo chương trình do nhiều gen điều khiển và kiểm soát. Một điều kiện trong xuất hiện và phát triển ung thư là tế bào mất cảm ứng với chết tế bào theo chương trình. Quá trình chết tế bào theo chương trình có thể xảy ra như sau [40],[41]: - Các kích thích từ bên ngoài (exogenous) như các hormon, thuốc điều trị, tia cực tím,... sẽ làm các chemokine hoạt hóa một receptor trên tế bào thuộc tuýp receptor APO-1 và Fas (tên khác của Fas là CD95 hay receptor của TNF). Tín hiệu này sẽ truyền đến một loại protein có tương tác vật lý với receptor đó ở domain gây chết (death domain - DD hay dead effector domain - DED) làm hoạt hóa một dây chuyền nhiều protease gây phân rã cystein, có tên gọi là capcase. Các caspase đầu tiên của chuỗi capcase (ICE/caspase 1, CPP31/caspase 3) sẽ gây phân rã một loạt các protein cấu trúc tế bào hay các

24 protein kiểm soát chu kỳ tế bào (pRb) hay các enzyme sửa chữa thương tổn ở DNA, protein của RNA thông tin trưởng thành làm cho các tế bào chết. Hình 1.6. Vai trò của gen TP53 trong quá trình phân bào [37] - Yếu tố kích thích nội sinh (endogenous) là gen TP53. Protein p53 xuất hiện khi có tổn thương DNA ở dạng đứt sợi đơn (SSB: single strand break) hay đứt sợi kép (DSB: double strand break) hay khi sai lệch về cấu trúc DNA. Protein p53 hoạt hóa trực tiếp chết tế bào theo chương trình hay gián tiếp thông qua các sản phẩm của gen Bcl-2 và Bax. Ngoài gen TP53, các SSB và DSB còn giải phóng ra topoisomerase I và II. Các topoisomerase của DNA được xem như là: “trạm gác khu vực” của bộ gen có trong một tế bào dù là bình thường hay ác tính. Các topoisomerase tách đôi sợi xoắn kép của DNA để sao chép P53 bình thường DNA bị tổn thương Quá trình sửa chữa tổn thương Sửa chữa không thành công dẫn đến TB chết theo chương trình Sửa chữa thành công tế bào nhân lên bình thường P53 đột biến DNA bị tổn thương Các tế bào tổn thương không được sửa chữa Phát triển thành các tế bào ung thư

25 hay sửa chữa tổn thương DNA bằng cách làm gãy sợi DNA (topoisomerase tuýp I làm gãy một sợi, tuýp II làm gãy 2 sợi) nên rất cần cho sự phân bào. Khi thiếu các topoisomerase, đặc biệt là tuýp II thì các nhiễm sắc thể không phân ly được, tế bào không phân bào được, dễ bị chết nhất là khi có tác động của kháng sinh và các thuốc gây độc tế bào (thuốc chống ung thư). Sự hằng định nội môi là do sự cân bằng giữa số lượng tế bào mới tái sinh và số tế bào già chết đi. Có nhiều nguyên nhân và cơ chế gây chết tế bào. Có thể các tế bào chết do các telomere (6 nucleotid cuối cùng của nhiễm sắc thể làm cho các đầu mút nhiễm sắc thể không dính vào nhau được) nên không bảo vệ được tính toàn vẹn trong nhân đôi DNA. Một số chết tế bào do thiếu oxy, do tác dụng nhiệt độ không thuận lợi cho sự sống của tế bào, do oxy hóa, do tia cực tím gây các tổn thương DNA quá lớn vượt quá khả năng sửa chữa của tế bào. 1.3.3. Các đột biến gen TP53 trong ung thư da Ý nghĩa của gen TP53 trong ung thư nói chung và ung thư da nói riêng vẫn đang được các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục nghiên cứu. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chứng minh rằng gen TP53 ức chế sự phát triển của ung thư, mã hóa cho protein p53 của nhân tế bào, điều hòa sự sinh sản và chết tế bào theo chương trình, ngăn ngừa đột biến DNA... Đột biến gen TP53 là biến đổi di truyền thường gặp nhất trong các ung thư ở người. Do gen TP53 điều hòa sự ổn định của bộ gen và ngăn cản tế bào bước vào chu trình phân bào khi có tổn thương DNA nên khi TP53 bị đột biến, mất chức năng sẽ liên quan đến khả năng ức chế sự phát triển tế bào, do đó sẽ tăng tỷ lệ tế bào sinh sản bất thường [45],[46],[47].

26 Hình 1.7. Tỷ lệ đột biến gen TP53 trong một số loại ung thƣ [48] Đột biến gen TP53 là biến đổi di truyền hay gặp trong nhiều loại ung thư ở người, đặc biệt là các loại ung thư da, phổi, vú và đại tràng... Các đột biến hầu hết là đột biến điểm trong vùng từ exon 2 đến 9, kết quả làm cho sản phẩm protein p53 mất chức năng, và nó trở nên bền vững hơn, gây tích tụ với một nồng độ cao trong nhân tế bào, tạo ra các sản phẩm gọi là protein p53 đột biến. Ở ung thư da đột biến thường xảy ra ở exon 2 đến exon 9 trên các vị trí sau: 175, 177, 248, 282 [35]. Khi tổn thương cả hai alen của gen TP53 thì DNA trong tế bào bị tổn thương sẽ không được sửa chữa, các đột biến còn tồn tại nhiều hơn khi chỉ tổn thương một alen và dẫn tế bào đến trạng thái chuyển dạng ác tính dễ dàng hơn. P53 là một protein nội bào nên nó được tìm thấy nhiều nhất ở các mô, nhưng cũng có thể gặp trong huyết thanh với nồng độ thấp (do thời gian bán hủy của protein p53 bình thường chỉ trong 20- 40 phút). Dựa vào nguyên lý của sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, người ta có thể xác định được các protein p53 có trong huyết thanh bằng kỹ thuật miễn dịch đánh dấu enzyme TỶ LỆ CÁC LOẠI UNG THƢ VÀ ĐỘT B IẾN P53

27 và protein p53 trong mô bằng kỹ thuật nhuộm HMMD. Khi gen TP53 bị đột biến dẫn đến protein của gen TP53 bị biến đổi thì nồng độ protein này tại mô có thể tăng cao đồng thời protein biến đổi có thời gian bán hủy kéo dài hơn và protein biến đổi này cũng được phát hiện bằng kỹ thuật nhuộm HMMD. Bệnh nhân ung thư da có đột biến gen TP53 liên quan đến giảm tỷ lệ sống thêm không tái phát và tỷ lệ sống thêm chung. Gen TP53 được coi là yếu tố tiên lượng độc lập về tỷ lệ sống thêm trong ung thư da. Protein p53 làm tăng tính nhạy cảm với xạ trị. Thiếu protein p53 làm tế bào trơ với xạ vì tế bào không dừng ở G1. Tuy nhiên nhạy cảm với xạ trị và hoá trị còn phụ thuộc nhiều protein khác nữa như pRb, oncoprotein… Trên thế giới nghiên cứu đột biến gen TP53 và sự biểu lộ protein p53 trong mô ung thư da cũng đã được nhiều tác giả quan tâm. Venza M. và cs cho rằng sự biểu lộ protein p53 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào vảy là 46,7% và không có sự khác biệt giữa ung thư da nguyên phát và ung thư da tái phát có di căn [49]. Bukhari M. H. và cs xác định đột biến gen TP53 và biểu lộ protein p53 đột biến ở 140 mẫu mô sinh thiết da cho thấy: cả hai dấu hiệu trên đều không phát hiện được trên da bình thường, nhưng trong ung thư tế bào đáy là 70% và trong ung thư tế bào vảy là 96,25% và đột biến gen TP53 có liên quan đến sự biểu lộ protein đột biến với [50]. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Mlmquist L. M. và cs cho thấy có mối liên quan giữa đột biến gen TP53 và sự biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thư da [51]. Như vậy protein p53 là một yếu tố quan trọng trong theo dõi, tiên lượng ung thư da. Những trường hợp đột biến gen TP53 thường có đáp ứng kém với điều trị hoá chất, do đó xác định tình trạng biểu lộ protein này được dùng để đánh giá khả năng đáp ứng với hoá chất và tia xạ trong điều trị. Ở Việt Nam cũng có một số tác giả nghiên cứu sự biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thư như kết quả nghiên cứu của Tạ Văn Tờ cho thấy tỷ lệ protein p53 dương tính trong mô ung thư biểu mô tuyến vú là 42,1%