Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thư da và mối liên quan của nó với các thể bệnh

98 làm cho sản phẩm protein mất chức năng nhưng nó lại trở nên bền vững hơn và gây tích tụ với một nồng độ cao trong nhân tế bào, tạo ra các sản phẩm gọi là protein p53 đột biến. Kết quả đột biến gen TP53 hoặc biểu lộ protein p53 đột biến có thể giúp các nhà lâm sàng can thiệp điều trị khôi phục lại chức năng của protein p53 đột biến cũng như cảm ứng quá trình tế bào chết theo chương trình là một cách đầy hứa hẹn để điều trị bệnh ung thư. Trong thực tế, một số phương pháp điều trị ung thư đã tác động theo cơ chế chết tế bào theo chương trình cũng đang được nghiên cứu và ứng dụng. Theo nghiên cứu của Aggarwal và CS có thể kích hoạt lại chức năng của protein p53 bị đột biến bằng PEITC (phenethyl isothiocyanate), đặc biệt trong các trường hợp có đột biến ở vùng R175. Nghiên cứu cơ chế cho thấy PEITC gắn vào vị trí đột biến đặc biệt vị trí R175 từ đó khôi phục chức năng của phân tử protein p53 bị đột biến, cảm ứng quá trình chết theo chương trình của tế bào [128]. Nghiên cứu của Zhang M. và CS đã sử dụng các chất ức chế quá trình gắn protein p53 bị đột biến với Mdm2 gây phá vỡ các liên kết này hoặc ức chế các proteasom có thể làm tăng cường hoạt động của các phân tử protein p53 [129]. Nghiên cứu của Fujjta Y. và CS cho thấy khôi phục chức năng của protein p53 đột biến bằng các chất có trọng lượng phân tử nhỏ gắn vào vùng đột biến có thể ngăn chặn sự hình thành và phát triển ung thư [130],[131]. Nghiên cứu của Tang X. và CS cũng cho thấy phân tử CP-31398 phục hồi chức năng ức chế khối u của protein p53 và ức chế sự hình thành ung thư da do UVB gây ra ở chuột [132]. Vì vậy, nghiên cứu này của chúng tôi bước đầu góp phần vào việc tìm

99 ra các điểm đột biến trên gen TP53, từ đó có thể có những gợi ý cho các nhà lâm sàng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị bổ trợ mới thay thế hoặc phối hợp với các phương pháp điều trị bổ trợ hiện nay. 4.3. ĐỘT BIẾN GEN BRAF (V600E) Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ DA Sự phát triển, biệt hóa và sống còn của tế bào bình thường được điều hòa bởi một số lượng giới hạn các con đường tín hiệu. Các con đường tín hiệu truyền và kết hợp các tín hiệu từ ngoại bào như các yếu tố phát triển, hormon, các liên kết tế bào-tế bào, tế bào-khoảng gian bào thông qua các thụ thể trên màng tế bào đi vào bên trong tế bào, rồi tiếp tục qua các protein dẫn truyền trong bào tương để đi vào nhân tế bào. Ở đây, chúng hoạt hóa các gen sao chép dẫn đến sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Các loại protein tín hiệu, protein màng, protein bào tương và protein nhân liên quan đến tăng sinh, biệt hóa tế bào đều là sản phẩm của c-oncogen (proto-oncogen) trong điều kiện bình thường. Khi có sự mất điều hòa hoạt động của chúng, các c-oncogen đột biến trở thành oncogen có thể xuất hiện ung thư và trong tình huống này con đường tín hiệu sẽ trở thành “con đường tín hiệu sinh ung thư”. Sự mất cân bằng giữa gen sinh ung thư và gen ức chế ung thư, sự hoạt động không phù hợp hoặc sự bất hoạt của các con đường tín hiệu là yếu tố quyết định đối với sự phát triển ung thư ở người. Nhiều gen sinh ung thư và nhiều gen ức chế ung thư cũng hoạt động trong khuôn khổ “con đường tín hiệu sinh ung thư” này [50],[51]. Yếu tố tín hiệu RAF thuộc con đường tín hiệu MAPK có ba đồng dạng là ARAF, BRAF và CRAF. Đồng dạng CRAF biểu lộ khắp nơi trong khi BRAF biểu lộ ở mức cao hơn trong tế bào máu, thần kinh và tinh hoàn [72], BRAF là đồng dạng nổi trội ở tế bào da. Mặc dù tất cả các đồng dạng RAF đều hoạt hoá MEK nhưng chúng được hoạt hoá một cách khác nhau bởi RAS. Theo Peyssonnaux C. và cs thì BRAF có ái tính cao hơn với MEK1 và MEK2

100 và có nhiều khả năng photphoryl hóa MEK hơn các đồng dạng RAF khác [70],[71],[72]. Sự thay đổi này dẫn đến con đường tín hiệu MAPK bị kích hoạt liên tục và không đáp ứng với sự kiểm soát thông thường. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng tiến hành xác định đột biến BRAF trên bệnh nhân ung thư da các thể ung thư tế bào đáy, ung thư tế bào vảy và ung thư tế bào hắc tố bằng 2 phương pháp song song nhau, từ đó đánh giá ưu nhược điểm của từng phương pháp và độ tương đồng về kết quả của hai phương pháp. Để xác định đột biến gen BRAF (V600E) trong mô ung thư da chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen. Để xác định biểu lộ protein BRAF(V600E) đột biến trong mô ung thư da chúng tôi sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch. 4.3.1. Phân tích đột gen BRAF (V600E) ở bệnh nhân ung thư da Các mẫu tách chiết DNA từ mô ung thư da của các bệnh nhân được sử dụng đồng thời xác định đột biến gen TP53 và đột biến gen BRAF. Các mẫu sau khi chiết tách DNA đều được tiến hành kiểm tra số lượng và độ tinh sạch của DNA đảm bảo cho phản ứng PCR. Với gen BRAF chúng tôi đã tiến hành giải trình tự nucleotid của gen sau đó dùng phần mềm biodit xác định đột biến ở vị trí V600E, việc giải trình tự được tiến hành cả theo 2 chiều xuôi và ngược, kỹ thuật giải trình tự và máy móc trang thiết bị cũng được tiến hành với cùng gen TP53. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với gen BRAF lên rõ ràng đảm bảo cho chất lượng phân tích trình tự gen BRAF. Sau khi thu được sản phẩm khuếch đại đoạn gen BRAF, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen BRAF. Với trình tự gen BRAF thu được, bằng phần mềm Biodit, chúng tôi so sánh với trình tự của gen BRAF trên genebank để xác định đột biến BRAF (V600E). Đột biến gen BRAF trong ung thư nói chung và ung thư da nói riêng thường xảy ra ở vị trí: A1023G (P341P); A1227G (S409S); T1799A

101 (V600E); A1383G (Q461Q); A1797C (T599T); A1929G (G643G); G2272A (G758R). Trong đó vị trí 1799 TA làm thay thế acid amin valine bằng glutamate của chuỗi polypeptid (V600E), đột biến này chiếm tỷ lệ khá cao khoảng 80-90% [73]. Đột biến V600E của gen BRAF là đột biến ở codon thứ 600, trong đó bộ ba GTG mã hóa cho Valine (V) bị thay thế bởi bộ ba GAG mã hóa cho Glutamate (E), nucleotid Thymine bị thay thế bởi nucleotid Adenine. Đây là đột biến hay gặp nhất trong ung thư da theo kết quả của các tác giả nghiên cứu ở các nước. Về kỹ thuật phân tích chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen là một kỹ thuật đảm bảo chính xác nên việc không phát hiện thấy đột biến gen BRAF (V600E) của chúng tôi là tin cậy. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen BRAF (V600E) trên 63 bệnh nhân ung thư da gồm 3 thể hay gặp là ung thư tế bào đáy, ung thư tế bào vảy và ung thư tế bào hắc tố. Kết quả chúng tôi phát hiện thấy đột biến V600E của gen BRAF ở 1/63 bệnh nhân ung thư da chiếm tỷ lệ 1,6%. Các thể ung thư tế bào đáy và ung thư tế bào vảy không phát hiện thấy có đột biến, 1 bệnh nhân có đột biến gen BRAF (V600E) là ở thể ung thư tế bào hắc tố. Các kết quả nghiên cứu về đột biến gen BRAF (V600E) cũng rất khác nhau. Các nghiên cứu ở người châu Âu tỷ lệ đột biến gen BRAF (V600E) khá cao như nghiên cứu của Paul T.C. và cs đã khám phá rằng biến đổi hoạt tính gen sinh ung thư BRAF xảy ra ở 2/3 các u hắc tố ác tính và ở tần suất cao trong các ung thư khác. 70% đột biến gen BRAF được tìm thấy ở những bệnh nhân ung thư da [45], trong khi đó nghiên cứu của Hugdah E. và CS cho thấy đột biến gen BRAF(V600E) là 35% [134], nghiên cứu của Mar V. J. và CS cho thấy tỷ lệ đột biến này là 39,2% [35]. Các nghiên cứu ở châu Á cho thấy tỷ đột biến gen BRAF(V600E) thấp hơn, trong nghiên cứu của Si L. và CS thì tỷ lệ đột biến gen BRAF của người Trung Quốc là 25,5%, trong đó đột biến

102 tại vị trí V600E chiếm 89,1% [136]. Một nghiên cứu khác trên người Đài Loan của Sheen Y. S. và CS, tỷ lệ đột biến gen BRAF là 14,3% trong trong đó đột biến tại vị trí V600E chiếm 88,2% [137]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn các tác giả khác đã nghiên cứu về đột biến gen BRAF(V600E). Đột biến gen BRAF(V600E) có tỷ lệ khác nhau có thể do vùng địa lý khác nhau, chủng tộc khác nhau, tập quán sinh hoạt khác nhau. Nghiên cứu của Thomas N. E. và CS cho thấy có mối liên quan giữa đột biến gen BRAF với tuổi và màu tóc, tuổi trẻ hơn, màu tóc nâu, vàng có tỷ lệ đột biến gen cao hơn [138]. Vì vậy có thể đây cũng là điểm khác biệt ở Việt Nam so với các nước khác, điều này góp phần giải thích tỷ lệ ung thư da ở Việt Nam không cao. 4.3.2. Xác định biểu lộ protein BRAF đột biến ở mô ung thư da Trên các mẫu đúc parafin chúng tôi tiến hành kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định sự biểu lộ của protein BRAF đột biến V600E. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, với 63 bệnh nhân gồm 3 nhóm ung thư da chủ yếu là ung thư tế bào đáy, ung thư tế bào vảy và ung thư tế bào hắc tố, cũng chỉ có 1 trường hợp có biểu lộ protein BRAF(V600E) đột biến là mẫu ung thư tế bào hắc tố. Bệnh nhân dương tính này cũng chính là bệnh nhân có đột biến gen BRAF (V600E) ở phương pháp giải trình tự gen. Như vậy kết quả của hai phương pháp này tương đồng với nhau, với các mẫu phương pháp giải trình tự gen xác định là không có đột biến gen BRAF (V600E) thì ở phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch cũng cho kết quả âm tính. Vì vậy, để xác định đột biến protein BRAF (V600E) có thể dùng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch thay thế cho phương pháp giải trình tự gen. Ưu điểm của phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch là thời gian thực hiện xét nghiệm ít hơn và kinh phí để thực hiện cũng tiết kiệm hơn. Hơn nữa, phương pháp giải trình tự gen là phương pháp phức tạp hơn, đòi hỏi trang thiết bị cao cấp hơn, không thể thực hiện ở các cơ sở xét nghiệm với qui mô nhỏ.

103 Các nghiên cứu đã khẳng định sự biến đổi gen BRAF là dấu ấn quan trọng của kiểu hình lâm sàng và mô bệnh học của ung thư da, đặc biệt là ung thư tế bào hắc tố, nó trở thành một dấu ấn chẩn đoán và tiên lượng có giá trị. Dựa vào việc sử dụng các chất ức chế protein BRAF [139], các nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc chẩn đoán sớm cũng như triển vọng điều trị cho bệnh nhân ung thư da từ đó cải thiện thời gian sống thêm của bệnh nhân [140]. Các nghiên cứu cũng phát hiện ra rằng khoảng 50% khối u ác tính có gen BRAF đã đột biến hoặc kích hoạt đã tạo ra một hướng mới quan trọng trong điều trị u ác tính. Có 2 loại thuốc ức chế protein BRAF đột biến là Dabrafenib (Tafinlar) và vemurafenib (Zelboraf) đã được FDA chấp thuận cho những người có cả giai đoạn IV và giai đoạn III melanoma mà không thể được phẫu thuật cắt bỏ. Những loại thuốc này, được sử dụng đặc biệt khi trên các bệnh nhân ung thư tế bào hắc có đột biến V600E hoặc V600K trong gen BRAF. Những loại thuốc này không nên được sử dụng cho những bệnh nhân không có đột biến vì nó không thực sự có hiệu quả [141]. Trong các thử nghiệm lâm sàng cho những người có u ác tính di căn mang gen BRAF bị biến đổi, cả hai loại thuốc trên đều có tác dụng làm giảm kích thước khối u ở phần lớn những bệnh nhân này. Vemurafenib cho thấy sự kéo dài sự sống còn của bệnh nhân trung bình gần một năm. Tác dụng của Dabrafenib đối với thời gian sống thêm toàn bộ đã được kiểm chứng chính thức. Dựa trên những thử nghiệm lâm sàng này, cả hai loại thuốc trên đều được chấp thuận sử dụng cho những bệnh nhân có u ác tính giai đoạn III mà không thể loại bỏ được bằng phẫu thuật và cho bệnh nhân khối u ác tính giai đoạn IV, nếu u ác tính có gen BRAF bị biến đổi. Một nghiên cứu gần đây cũng cho thấy, sử dụng phối hợp các chất ức chế protein BRAF với các chất ức chế con đường tín hiệu MAPK, thụ thể

104 EGFR hay các con đường khác như PIK3 cho hiệu quả cao hơn có ý nghĩa so với chỉ dùng ức chế protein BRAF đơn thuần [142]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ đột biến gen BRAF (V600E) ở bệnh nhân ung thư da là khá thấp, kết quả này cũng góp phần định hướng cho các nhà lâm sàng cần hướng đến việc tìm các vị trí khác của gen hoặc các nguyên nhân khác, các gen khác góp phần vào cơ chế bệnh sinh trong ung thư da nói chung và ung thư tế bào hắc tố nói riêng. Từ đó tìm ra hướng điều trị bổ trợ nhằm ức chế các yếu tố gây phát sinh ung thư da. 4.4. MỐI LIÊN QUAN GIỮA BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN VÀ UNG THƢ DA Ngày nay, hầu hết các tác giả cho ung thư là bệnh di truyền. Các tế bào ung thư đều là những tế bào có đột biến (có thể là đột biến gen hoặc đột biến nhiễm sắc thể), các đột biến này tạo ra các protein bất thường, tác động gây tăng quá trình phân bào. Trong chu kỳ tế bào, trước khi phân bào, ở giai đoạn G1 có sự sửa chữa những sai sót trong di truyền trước khi DNA nhân đôi, sau khi nhân đôi DNA ở giai đoạn G2 cũng có sự sửa chữa các sai sót sau nhân đôi. Do tăng phân bào quá nhiều dẫn đến tế bào không còn khả năng sửa chữa các bất thường trước và sau mỗi quá trình phân bào nên gây ra các loại đột biến và gây hiện tượng quá sản. Do tăng quá nhanh quá trình phân bào, tế bào cũng sẽ không có đủ thời gian trưởng thành từ đó hình thành nên các tế bào bất thường đó chính là các tế bào ung thư. Có 2 nhóm gen liên quan đến ung thư là nhóm gen gây ung thư (các proto-oncogen) và các gen chống ung thư. Proto-oncogen có 2 loại C-proto oncogen là gen ở trong tế bào và V-oncogen (có nguồn gốc từ virus). Nếu các proto-oncogen chuyển thành oncogen nó sẽ gây ung thư. Nhóm thứ 2 là các gen chống ung thư. Nếu các gen chống ung thư bị đột biến thì nó không còn khả năng khống chế ung thư cũng sẽ gây ung thư.

105 Với ung thư da gen gây ung thư thường gặp là RAF với 3 biến thể (ARAF, BRAF và CRAF), trong đó gen BRAF và gen CRAF liên quan nhiều hơn, liên quan nhiều nhất là gen BRAF. Các gen chống ung thư liên quan nhiều với ung thư da là TP53, gen Hedgehog, gen Patched… Đây cũng chính là lý do chúng tôi lựa chọn 2 gen điển hình là gen BRAF và gen TP53 thuộc hai nhóm gen phát sinh ung thư và nhóm gen ức chế sinh ung thư vào nghiên cứu. Theo các tác giả, đột biến gen TP53 gặp cao nhất ở 70% bệnh nhân ung thư da. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ đột biến gen TP53 phát hiện được là 27% ung thư da nói chung. Nếu chỉ tính ung thư da loại tế bào đáy thì tỷ lệ này là 66,7%, trong đó các đột biến xảy ra 25,4% ở exon 3, 1,6% ở exon 4 và 12,7% ở exon 6, tỷ lệ này thấp hơn với các tác giả khác. Vai trò của Human Papilloma virus (HPV) trong ung thư da: nhiều nghiên cứu cho thấy sự tương quan giữa HPV và ung thư da (Karagas). Vai trò của HPV type 5 và 8 trong bệnh dị sản thượng bì dạng hạt cơm (Epidermodisplasia veruciforme) đã được làm rõ (Pastel). Protein E6 của HPV ức chế hoạt động của một số protein trong đó có protein p53, từ đó làm giảm khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư. Ngoài ánh sáng mặt trời và HPV, nhiễm độc một số kim loại nặng như arsenic cũng là nguyên nhân của ung thư da nhất là ung thư biểu mô tế bào vảy. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tỷ lệ ung thư tế bào vảy cao ở những vùng có nước sinh hoạt bị nhiễm arsenic [143]. Ở những người có nồng độ arsenic cao trong móng có nguy cơ mắc ung thư tế bào vảy cao gấp gần hai lần so với người bình thường [144]. Ngoài ra, rất nhiều nghiên cứu đề cập đến tác dụng của thuốc lá, các chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu hại, chất diệt nấm cũng là những nguyên nhân gây ung thư tế bào vảy [145]. Các đột biến mới phát sinh có thể tác động vào gen chống đột biến TP53 hoặc tác động vào các gen gây ung thư như BRAF. Các yếu tố môi

106 trường ở Việt Nam cũng cần được lưu tâm. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ đột biến V600E ở gen BRAF rất thấp có thể có các khả năng sau: - Có thể ở Việt Nam đột biến V600E ở gen BRAF không phổ biến mà có thể lại có đột biến ở vị trí khác. Để khẳng định điều này cần có các nghiên cứu tiếp theo với cỡ mẫu lớn hơn và phân tích đầy đủ hơn ở các vùng khác của gen BRAF. - Có thể đột biến BRAF ở Việt Nam là thấp hơn các nước khác. Có lẽ đây là lý do chính làm cho tỷ lệ ung thư da ở Việt Nam thấp hơn các nước như Australia, Mỹ và một số nước châu Âu. Nói cách khác, tỷ lệ người mang gen gây ung thư da loại BRAF (V600E) ở Việt Nam thấp, nhưng tỷ lệ đột biến gen chống ung thư như gen TP53 thì lại tương tự như các nghiên cứu khác ở các nước khác. 4.5. BÀN LUẬN VỀ ƢU NHƢỢC ĐIỂM CỦA QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN TP53 VÀ BRAF TRONG UNG THƢ DA Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, kỹ thuật xác định đột biến gen TP53 và BRAF bằng giải trình tự gen và hóa mô miễn dịch đều cho kết quả tương đồng nhau. Đối với đột biến gen BRAF (V600E) các nhà lâm sàng có thể lựa chọn phương pháp hóa mô miễn dịch thay cho phương pháp giải trình tự gen. Vì cả hai phương pháp này đều xác định được đột biến xảy ra ở vị trí V600E, phương pháp giải trình tự gen cho phép phát hiện được nucleotid bị thay thế ở vị trí g.1799T>A làm biến đổi codon ở vị trí 600, bộ ba GTG mã hóa cho acid amin Valine được thay thế bằng bộ ba GAG mã hóa cho acid amin Glutamate. Phương pháp hóa mô miễn dịch, với việc sử dụng kháng thể đơn dòng của chuột (kháng thể 1) chống kháng nguyên là phân tử protein đột biến V600E cho phép phát hiện được các đột biến tại vị trí này. Với phương pháp giải trình tự gen thì ngoài việc xác định đột biến V600E, có thể xác định được đột biến khác như V600K hoặc các đột biến xảy ra ở các

107 acid amin khác nữa. Với kỹ thuật hóa mô miễn dịch xác định đột biến protein BRAF (V600E) thì chỉ xác định được đột biến V600E có hay không mà không xác định được các đột biến khác. Kỹ thuật Hóa mô miễn dịch sẽ thực hiện đơn giản hơn, thời gian thực hiện kỹ thuật nhanh hơn, thời gian trả kết quả cho bệnh nhân sẽ ngắn hơn và giá thành thực hiện sẽ thấp hơn kỹ thuật giải trình tự gen. Với gen TP53, kỹ thuật hóa mô miễn dịch chỉ xác định được biểu lộ protein p53 đột biến chung, không xác định được xem đột biến ở vị trí acid amin nào. Phương pháp giải trình tự gen sẽ khắc phục được hạn chế đó, phương pháp này xác định được đột biến ở vị trí nào của gen TP53 từ đó xác định được vị trí các acid amin bị biến đổi. Vì vậy khi bác sĩ lâm sàng cần xác định đột biến gen TP53 chung thì nên sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch, khi cần xác định chính xác vị trí đột biến của gen TP53 thì lựa chọn phương pháp giải trình tự gen. Từ đó lựa chọn phương pháp điều trị bổ trợ khôi phục lại chức năng của gen TP53 chung hay gắn các phân tử vào các vị trí đột biến để khôi phục chức năng của gen TP53.