Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thư da và mối liên quan của nó với các thể bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI HỒ QUANG HUY NGHIÊN CỨU CÁC ĐỘT BIẾN TP53, BRAF TRONG MÔ UNG THƢ DA VÀ MỐI LIÊN QUAN CỦA NÓ VỚI CÁC THỂ BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI HỒ QUANG HUY NGHIÊN CỨU CÁC ĐỘT BIẾN TP53, BRAF TRONG MÔ UNG THƢ DA VÀ MỐI LIÊN QUAN CỦA NÓ VỚI CÁC THỂ BỆNH Chuyên ngành : Dị ứng và miễn dịch Mã số : 62720109 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Phạm Đăng Khoa 2. PGS. TS. Phan Thị Hoan HÀ NỘI - 2020

LỜI CAM ĐOAN Tôi là: Hồ Quang Huy, nghiên cứu sinh khóa 30 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Dị ứng và Miễn dịch, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phạm Đăng Khoa và PGS.TS. Phan Thị Hoan. 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Ngƣời viết cam đoan Hồ Quang Huy

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, trường Đại học Y Hà Nội luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phạm Đăng Khoa và PGS. TS. Phan Thị Hoan, những người thầy có nhiều kiến thức, kinh nghiệm đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài cũng như hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch, Bộ môn Y sinh học - Di truyền và Bộ môn Giải phẫu bệnh trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn những bệnh nhân đã tự nguyện tham gia và cung cấp các thông tin cho nghiên cứu này. Đặc biệt, tôi xin cám ơn những người thân trong gia đình đã hết lòng ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và là động lực giúp tôi vượt qua những khó khăn để đạt được kết quả khóa học và hoàn thành luận án. Tác giả luận án Hồ Quang Huy

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG BIỂU .......................................................................... viii DANH MỤC HÌNH VẼ ................................................................................. ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... xi ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. CÁC THỂ LÂM SÀNG UNG THƢ DA ............................................. 3 1.1.1. Cấu trúc da ....................................................................................... 3 1.1.1.1. Thượng bì .................................................................................... 3 1.1.1.2. Trung bì....................................................................................... 4 1.1.1.3. Hạ bì ........................................................................................... 5 1.1.2. Dịch tễ ung thư da ........................................................................... 5 1.1.3. Yếu tố nguy cơ của ung thư da ....................................................... 6 1.1.3.1. Ánh sáng mặt trời ....................................................................... 6 1.1.3.2. Asen ............................................................................................. 7 1.1.3.3. Bức xạ ion hóa ............................................................................ 7 1.1.3.4. Yếu tố cá thể ................................................................................ 7 1.1.3.5. Các yếu tố khác ........................................................................... 8 1.1.4. Phân loại ung thư da ....................................................................... 8 1.1.4.1. Ung thư biểu mô tế bào đáy (Basal cell carcinoma -BCC)........ 9 1.1.4.2. Ung thư tế bào vảy (Squamous cell carcinoma - SCC) .............. 9 1.1.4.3. Ung thư tế bào hắc tố ............................................................... 10 1.2. SINH LÝ BỆNH HỌC QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN UNG THƢ DA ...................................................................................................................... 10

1.2.1. Kiểm soát sự phân chia, sinh trưởng của tế bào .......................... 10 1.2.2. Các cơ chế phát sinh ung thư ........................................................ 11 1.2.2.1. Mô hình chung của phát sinh ung thư ...................................... 11 1.2.2.2. Các con đường tín hiệu trong ung thư ...................................... 12 1.2.2.3. Oncogen (gen sinh ung thư hay gen ung thư) ......................... 15 1.2.2.4. Gen sửa chữa DNA ................................................................... 17 1.2.2.5. Đột biến nhiễm sắc thể gây ung thư ......................................... 18 1.2.2.6. Ung thư phát sinh do sự tương tác của môi trường và di truyền ................................................................................................................ 19 1.3. GEN TP53 VÀ UNG THƢ DA........................................................... 19 1.3.1. Cấu trúc và sản phẩm của gen TP53 ............................................ 19 1.3.2. Vai trò của gen TP53 trong cơ chế bệnh sinh ung thư da ........... 23 1.3.3. Các đột biến gen TP53 trong ung thư da ...................................... 25 1.4. GEN BRAF VÀ UNG THƢ DA ......................................................... 28 1.4.1. Cấu trúc gen BRAF ....................................................................... 28 1.4.2. Gen BRAF và con đường tín hiệu sinh ung thư .......................... 29 1.4.2.1. Quá trình hoạt động của con đường tín hiệu MAPK ............... 30 1.4.2.2. Vai trò con đường tín hiệu MAPK trong ung thư ..................... 31 1.4.2.3. Đột biến gen BRAF trong ung thư da ....................................... 33 1.5. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN TP53 VÀ GEN BRAF ........................................................................................... 34 1.5.1. Phương pháp giải trình tự gen ...................................................... 34 1.5.1.1. Phương pháp giải trình tự gen Sanger ........................................ 34 1.5.1.2. Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới NGS (Next Generation Sequencing) [79] ....................................................................................... 36 1.5.2. Phương pháp realtime PCR Taqman Probe [80] ......................... 39 1.5.3. Phương pháp lai phân tử Southern blot ....................................... 39

1.5.4. Phương pháp hóa mô miễn dịch (HMMD)................................ 40 1.5.2.1. Nguyên lý kỹ thuật .................................................................... 40 1.5.1.2. Các kỹ thuật nhuộm miễn dịch enzyme [81] ............................ 42 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 44 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................ 44 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân ................................................. 44 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ........................................................................ 44 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 44 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ....................................................................... 44 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 45 2.2.2.1. Xác định các đột biến của gen P53 và BRAF ở mô ung thư da, các kỹ thuật sau được sử dụng: ............................................................. 45 2.2.2.2. Xác định biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thư da, sử dụng kỹ thuật: Hóa mô miễn dịch ......................................................... 45 2.2.2.3. Xác định mối tương quan giữa đột biến gen TP53 và biểu lộ protein p53 đột biến ở mô ung thư da. .................................................. 45 2.2.3. Các qui trình và kỹ thuật nghiên cứu ........................................... 45 2.2.3.1. Qui trình kỹ thuật tách chiết DNA tổng số từ mô ung thư ........ 45 2.2.3.2. Xác định nồng độ, độ sạch DNA bằng phương pháp quang phổ kế ............................................................................................................ 46 2.2.3.3. Phương pháp điện di kiểm tra DNA ......................................... 48 2.2.3.4. Kỹ thuật PCR khuếch đại gen BRAF và TP53 ......................... 48 2.2.3.5. Kỹ thuật giải trình tự và xác định các biến đổi gen TP53 và gen BRAF ...................................................................................................... 51 2.2.3.6. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch ....................................................... 51 2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................. 54 2.3.1. Thời gian nghiên cứu .................................................................... 54

2.3.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 54 2.4. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU ................................................. 54 2.5. QUẢN LÝ THÔNG TIN .................................................................... 55 2.6. PHÂN TÍCH XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................... 55 Chƣơng 3 KẾT QUẢ .................................................................................. 56 3.1. KẾT QUẢ VỀ THÔNG TIN CHUNG CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................................... 56 3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN GEN TP53 ..................... 57 3.2.1. Kết quả đột biến gen TP53 bằng phương pháp giải trình tự gen 57 3.2.1.1. Kết quả khuếch đại gen TP53 bằng kỹ thuật PCR ................... 57 3.2.1.2. Các vị trí đột biến trên các exon gen TP53 .............................. 58 3.2.1.3. Các vị trí đột biến trên các intron gen TP53 ............................ 60 3.2.1.4. Một số hình ảnh biến đổi gen TP53 qua phân tích gen bằng phương pháp xác định trình tự gen ....................................................... 61 3.2.1.4. Tỷ lệ biến đổi đoạn gen TP53 ở các mẫu ung thư da ............... 65 3.2.2. Kết quả xác định biểu lộ protein p53 đột biến bằng phương pháp hóa mô miễn dịch ..................................................................................... 72 3.2.2.1. Một số hình ảnh đột biến protein p53 trong mô ung thư da. ... 72 3.2.2.2. Kết quả xác định protein p53 đột biến trong mô ung thư da .. 74 3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN BRAF (V600E) Ở CÁC MẪU UNG THƢ DA ................................................................................. 74 3.3.1. Phân tích đột biến gen BRAF (V600E) bằng phương pháp giải trình tự gen ............................................................................................... 74 3.3.1.1. Kết quả khuếch đại gen BRAF .................................................. 74 3.3.1.2. Một số hình ảnh phân tích gen BRAF ...................................... 76 3.3.2. Kết quả xác định protein BRAF (V600E) trong mô ung thư da . 77 3.3.2.1. Hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch đột biến BRAF(V600E). .. 77

3.3.2.2. Kết quả biểu lộ protein BRAF đột biến (V600E) trong mô UT da ................................................................................................................ 78 Chƣơng 4 BÀN LUẬN ................................................................................. 80 4.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU ............ 80 4.2. ĐỘT BIẾN GEN TP53 TRONG UNG THƢ DA ............................. 81 4.2.1. Phân loại các biến đổi ở các đoạn gen TP53 ............................... 83 4.2.2. Về tỷ lệ biến đổi gen TP53 ở trong ung thư da ............................. 92 4.2.3. Biến đổi gen TP53 ở trong từng loại ung thư da ......................... 93 4.2.4. Phân tích biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thư da....... 95 4.3. ĐỘT BIẾN GEN BRAF (V600E) Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ DA ...................................................................................................................... 99 4.3.1. Phân tích đột gen BRAF (V600E) ở bệnh nhân ung thư da ..... 100 4.3.2. Xác định biểu lộ protein BRAF đột biến ở mô ung thư da ........ 102 4.4. MỐI LIÊN QUAN GIỮA BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN VÀ UNG THƢ DA .............................................................................................................. 104 4.5. BÀN LUẬN VỀ ƢU NHƢỢC ĐIỂM CỦA QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN TP53 VÀ BRAF TRONG UNG THƢ DA .... 106 KẾT LUẬN .................................................................................................. 108 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 110 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Một số oncogen thường gặp [37].................................................... 16 Bảng 1.2. Một số gen ức chế khối u [37] ........................................................ 18 Bảng 3.1. Phân bố tỷ lệ ung thư da theo tuổi .................................................. 56 Bảng 3.2. Phân bố tỷ lệ ung thư da theo giới .................................................. 57 Bảng 3.3. Các loại đột biến gen TP53 trên các đoạn exon ở các mẫu ung thư da (n=63) ...................................................................................... 59 Bảng 3.4. Các loại biến đổi gen TP53 trên các đoạn intron ở các mẫu ung thư da (n=63) ...................................................................................... 60 Bảng 3.5. Tỷ lệ biến đổi gen TP53 của các thể ung thư da ............................ 65 Bảng 3.6. Tỷ lệ biến đổi các đoạn gen TP53 của từng loại ung thư da .......... 66 Bảng 3.7. Biến đổi ở đoạn IVS1 trong các loại ung thư da ............................ 67 Bảng 3.8. Đột biến ở đoạn exon 3 ................................................................... 68 Bảng 3.9. Đột biến ở đoạn exon 4 ................................................................... 69 Bảng 3.10. Tỷ lệ đột biến ở đoạn Exon 6........................................................ 69 Bảng 3.11. Biến đổi phối hợp các điểm trên gen TP53 ở các loại ung thư da ...................................................................................................... 71 Bảng 3.12. Tỷ lệ biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thư da ............... 74 Bảng 3.13. Tỷ lệ đột biến gen BRAF ở các mẫu ung thư da ........................... 75 Bảng 3.14. Tỷ lệ biểu lộ protein BRAF(V600E) đột biến ở các mẫu UT da . 78