Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

61 Nhận xét: Từ bảng 3.20 và biểu đồ 3.7 cho thấy dưới tác dụng của CPE γ- amylase thương mại cố định trên chất mang chitosan tạo lượng glucose tỉ lệ thuận với thời gian phản ứng. Tại thời điểm 90 phút nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng đạt giá trị xấp xỉ cực đại là 591,942 μg/ml, còn với quá trình thủy phân tinh bột tan đạt giá trị cực đại là 584,249 μg/ml. Từ 90 phút trở lên, lượng glucose tạo thành gần như không thay đổi. Mặt khác, lượng glucose tạo thành sau khi thủy phân tinh bột tan cao hơn so với thủy phân bột năng. Bên cạnh đó, khi so sánh kết quả này với bảng 3.18 chúng tôi nhận thấy rằng khi sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan để thủy phân bột năng, hàm lượng đường khử tạo thành bằng khoảng 36% so với sử dụng CPE- TM cđ _chitosan. Trong trường hợp thủy phân tinh bột tan bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan, hàm lượng đường khử tạo thành bằng khoảng 47% so với sử dụng CPE-TM cđ _chitosan. Như vậy, trong thực tế sản xuất thời gian thủy phân tinh bột không quá 90 phút vì lượng glucose hầu như không tăng nữa. Hiệu suất thủy phân CPE_TM cao hơn CPE từ Asp. niger, nhưng nếu trong sản xuất sử dụng CPE_TM thì chi phí sản xuất tang cao hơn nhiều. Nồng độ glucose (μg/ml) Bột năng Tinh bột tan 30 60 90 120 150 180 210 Thời gian (phút) Biểu đồ 3.7: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột bằng CPE γ-amylase thương mại cố định trên chitosan

62 Bảng 3.21: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột khác nhau bằng CPE γ-amylase – TM cố định trên chất mang diatomite Cơ chất Thời gian (phút) OD TB ∆OD Nồng độ glucose (μg/mlx2000)/dd TN1 TN2 TN3 Bột năng 0 0,064 0,065 0,063 0 0 30 0,353 0,352 0,351 0,288 315,821 60 0,466 0,465 0,467 0,402 442,205 90 0,590 0,594 0,598 0,530 582,489 120 0,619 0,621 0,624 0,557 612,744 150 0,620 0,620 0,621 0,556 611,553 180 0,617 0,620 0,623 0,556 611,081 210 0,625 0,622 0,620 0,558 613.380 Tinh bột tan 0 0,146 0,144 0,144 0 0 30 0,477 0,478 0,476 0,419 365,204 60 0,546 0,570 0,575 0,365 460,701 90 0,751 0,754 0,757 0,609 669,803 120 0,750 0,750 0,751 0,605 665,824 150 0,751 0,749 0,752 0,604 666,729 180 0,748 0,750 0,753 0,606 666,056 210 0,750 0,751 0,749 0,606 665,289 Nồng độ glucose (μg/ml) Bột năng Tinh bột tan 30 60 90 120 150 180 210 Thời gian (phút) Biểu đồ 3.8 : Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột bằng CPE γ-amylase thương mại cố định trên diatomite

63 Nhận xét: Từ bảng 3.21 và biểu đồ 3.8 cho thấy dưới tác dụng của CPE γ- amylase thương mại cố định trên chất mang diatomite tạo hàm lượng glucose tỉ lệ thuận với thời gian phản ứng. Tại thời điểm 90 phút, nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng đạt giá trị cực đại là 582,489μg/ml, còn với quá trình thủy phân tinh bột tan đạt giá trị cực đại là 669,803 μg/ml. Từ 90 phút trở lên, lượng glucose tạo thành gần như không thay đổi. Mặt khác, lượng glucose tạo thành sau khi thủy phân tinh bột tan cao hơn so với thủy phân bột năng. Bên cạnh đó, khi so sánh kết quả này với bảng 3.19 chúng tôi nhận thấy rằng khi sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên diatomite để thủy phân bột năng, hàm lượng đường khử tạo thành bằng khoảng 49% so với sử dụng CPE- TM cđ _diatomite. Khi thủy phân tinh bột tan bằng CPE từ Asp. niger dạng hòa tan, hàm lượng đường khử tạo thành bằng khoảng 82% so với sử dụng CPE-TM cđ _diatomite. 3.14. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase cố định 3.14.1. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định Chúng tôi cố định CPE γ-amylase từ Asp. niger trên diatomite và chitosan, áp dụng phương pháp phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.13 để khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.22, 3.23 và đồ thị 3.9, 3.10 Bảng 3.22: Hiệu suất sử dụng CPE từ Asp. niger cố định trên chitosan Số lần sử dụng OD TB ∆OD Nồng độ glucose (μg/ml)/dd Hoạt độ (UI/gCPE cđ ) Hiệu suất sử dụng CPE cđ TN1 TN2 TN3 1 0,482 0,482 0,480 0,481 9627 4332 100 2 0,465 0,468 0,467 0,467 9333 4200 96,95 3 0,411 0,406 0,408 0,408 8167 3675 84,83 4 0,384 0,385 0,387 0,385 7707 3468 80,06 5 0,269 0,270 0,270 0,270 5393 2427 56,02 6 0,254 0,256 0,254 0,255 5093 2292 52,91 7 0,215 0,215 0,214 0,215 4293 1932 44,60 8 0,210 0,213 0,211 0,211 4227 1902 43,91 9 0,212 0,212 0,213 0,212 4247 1911 44,11 10 0,210 0,212 0,213 0,212 4233 1905 43,98

64 Biểu đồ 3.9 : Khả năng tái sử dụng CPE cđ _chitosan từ canh trường Asp. niger Nhận xét: Từ bảng 3.22 và biểu đồ 3.9 cho thấy qua mỗi lần tái sử dụng hoạt độ của CPE γ-amylase từ Asp. nige r cố định trên chất mang chitosan giảm dần, nên hàm lượng glucose cũng giảm tương ứng với hoạt độ. Từ đó hiệu suất sử dụng CPE cđ _chitosan cũng giảm dần, từ 100% xuống còn 44,60% ở lần tái sử dụng thứ bảy, sau đó hiệu suất không thay đổi, điều này cũng chứng tỏ CPE cđ _chitosan đạt hiệu quả tốt ở những lần đầu tiên, sau đó giảm dần đến lần thứ 7 là giảm tốc độ phản ứng . Bảng 3.23: Hiệu suất sử dụng CPE từ Asp. niger cố định trên diatomite Số lần sử dụng OD TB ∆OD Nồng độ glucose (μg/ml)/dd Hoạt độ (UI/gCPE cđ ) Hiệu suất sử dụng CPE cđ TN1 TN2 TN3 1 0,682 0,680 0,681 0,681 13620 6129 100 2 0,565 0,567 0,565 0,566 11313 5091 83,06 3 0,507 0,505 0,502 0,505 10093 4542 74,11 4 0,475 0,477 0,477 0,476 9527 4287 69,95 5 0,454 0,450 0,453 0,452 9047 4071 66,42 6 0,439 0,445 0,442 0,442 8840 3978 64,90 7 0,397 0,389 0,395 0,394 7873 3543 57,81 8 0,366 0,365 0,367 0,366 7320 3294 53,74 9 0,368 0,364 0,362 0,365 7293 3282 53,55 10 0,367 0,365 0,363 0,365 7300 3285 53,60 Nồng độ glucose Số lần tái sử dụng Hoạt độ chung Hoạt độ chung

65 Biểu đồ 3.10: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _diatomite từ canh trường Asp. niger Nhận xét: Từ bảng 3.23 và biểu đồ 3.10 cho thấy qua mỗi lần tái sử dụng hoạt độ của CPE γ-amylase từ Asp. nige r cố định trên chất mang diatomit giảm dần, nên hàm lượng glucose cũng giảm tương ứng với hoạt độ. Từ đó hiệu suất sử dụng CPE cđ _diatomite cũng giảm dần, từ 100% xuống còn 57,81% ở lần tái sử dụng thứ bảy, sau đó hiệu suất không thay đổi, điều này cũng chứng tỏ CPE cđ _diatomite đạt hiệu quả tốt ở những lần đầu tiên, sau đó giảm dần đến lần thứ 7 là phản ứng chậm lại. Đồ thị 3.8 : Hiệu suất sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan và trên diatomite Nhận xét: Từ bảng 3.22, 3.23 và đồ thị 3.8 cho thấy hiệu suất sử dụng CPE cđ _chitosan và CPE cđ _diatomite gần tương đương nhau ở những lần tái sử dụng Nồng độ glucose Hoạt độ chung Hoạt độ chung Số lần tái sử dụng CPE cđ _chitosan CPE cđ _diatomite Số lần tái sử dụng Hiệu suất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

66 đầu, sau đó giảm dần từ lần thứ 7 đến lần thứ 10 là tốc độ phản ứng giảm hơn một nửa so với lần đầu. Trong đó, hiệu suất của CPE cđ _chitosan thấp hơn CPE cđ _diatomite từ lần thứ sáu cho đến lần thứ mười. 3.14.2. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase cố định thương mại Chúng tôi cố định CPE γ-amylase thương mại trên diatomite và chitosan, áp dụng phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.13 để khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.24. Bảng 3.24: Hiệu suất sử dụng CPE cđ _chitosan thương mại Số lần sử dụng OD TB ∆OD Nồng độ glucose (μg/mlx2000)/dd Hoạt độ (UI/gCPE cđ ) Hiệu suất sử dụng CPE cđ (%) TN1 TN2 TN3 1 0,534 0,530 0,532 0,532 10640 4778 100.00 2 0,529 0,534 0,532 0,532 10633 4785 99,09 3 0,501 0,503 0,503 0,502 10047 4521 94,4 4 0,457 0,455 0,455 0,456 9113 4101 85,7 5 0,469 0,460 0,460 0,463 9260 4167 87,0 6 0,452 0,451 0,451 0,451 9027 4062 84,8 7 0,415 0,415 0,410 0,413 8267 3720 77,7 8 0,410 0,408 0,408 0,409 8173 3678 76,8 9 0,346 0,350 0,345 0,347 6940 3131 65,2 10 0,307 0,305 0,305 0,306 6113 2751 57,5 Nồng độ glucose/dd Hoạt độ chung Hoạt độ chung Số lần tái sử dụng Biểu đồ 3.11: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _chitosan thương mại

67 Nhận xét: Từ bảng 3.24 và biểu đồ 3.11 cho thấy qua mỗi lần tái sử dụng hoạt độ của CPE γ-amylase thương mại cố định trên chất mang chitosan giảm dần, nên lượng glucose tạo thành cũng giảm tương ứng với hoạt độ. Từ đó hiệu suất sử dụng CPE cđ _chitosan cũng giảm dần, từ 100% ở lần sử dụng đầu giảm xuống còn 57,50% ở lần tái sử dụng thứ mười. Bảng 3.25: Hiệu suất sử dụng CPE cđ _diatomite thương mại Số lần sử dụng OD TB ∆OD Nồng độ glucose (μg/ml)/dd Hoạt độ (UI/gCPE cđ ) Hiệu suất sử dụng CPE cđ (%) TN1 TN2 TN3 1 0,685 0,683 0,684 0,684 13680 6156 100 2 0,643 0,640 0,642 0.642 12833 5775 93,8 3 0,517 0,519 0,517 0,518 10353 4659 75,7 4 0,517 0,514 0,513 0,515 10293 4632 75,2 5 0,454 0,450 0,452 0,452 9040 4068 66,1 6 0,442 0,445 0,443 0,443 8867 3990 64,8 7 0,415 0,412 0,411 0,413 8253 3714 60,3 8 0,360 0,364 0,362 0,362 7240 3258 52,9 9 0,336 0,333 0,332 0,334 6673 3003 48,8 10 0,327 0,328 0,325 0,320 6533 2940 47,8 Biểu đồ 3.12 : Khả năng tái sử dụng CPE cđ _diatomite thương mại Nồng độ glucose / dd Hoạt độ chung Hoạt độ chung Số lần tái sử dụng

68 Đồ thị 3.9 : Hiệu suất sử dụng CPE γ-amylase thương mại cố định trên chitosan và trên diatomite Nhận xét: Từ bảng 3.24, 3.25, biểu đồ 3.12 và đồ thị 3.9 cho thấy qua mỗi lần tái sử dụng hoạt độ của CPE γ-amylase thương mại cố định trên chất mang diatomite giảm dần, nên hàm lượng glucose cũng giảm tương ứng với hoạt độ. Từ đó hiệu suất sử dụng CPE cđ _chitosan cũng giảm dần, từ 100% ở lần sử dụng đầu giảm xuống còn 57,50% ở lần tái sử dụng thứ mười. Tuy nhiên, với hiệu suất sử dụng ở lần thứ mười là 57,50% cho ta nhận định là hiệu suất sử dụng CPE γ-amylase thương mại cố định trên chất mang chitosan hiệu quả hơn trên chất mang là diatomite có hiệu suất 47,80%. 3.15. Kết quả ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh khối giàu protein 3.15.1. Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp. niger và thương mại thủy phân bột năng tạo dung dịch đường Phương pháp lên men thu sinh khối nấm men bằng dịch thủy phân bột năng nhờ CPE thu nhận từ Asp. niger và thương mại cố định trên chất mang chitosan và diatomite đã được trình bày ở mục 2.2.15.2. CPE cđ từ Asp. niger và thương mại được dùng để thủy phân bột năng tạo dung dịch đường, xác định lượng đường khử tạo thành theo phương pháp DNS, tiếp theo sử dụng dung dịch đường này bổ sung glucose đạt 12% để nuôi nấm men thu sinh khối. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.26 và biểu đồ 3.13. CPE cđ _chitosan CPE cđ _diatomite Số lần tái sử dụng Hiệu suất

69 Bảng 3.26 : Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp. niger và thương mại thủy phân bột năng tạo glucose CPE Nồng độ glucose (mg/ml)/dd Nồng độ glucose (mg/ml) TB /dd TN1 TN2 TN3 E cđ _chitosan từ Asp. niger 9,627 9,619 9,608 9,618 ± 0,010 E cđ _diatomite từ Asp. niger 13,620 13,601 13,740 13,654 ± 0.075 E cđ _chitosan thương mại 10,640 10,597 10,742 10,660 ± 0.074 E cđ _diatomite thương mại 13,680 13,836 13,745 13,754 ± 0.078 Biểu đồ 3.13: Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp. niger và thương mại thủy phân bột năng tạo glucose Nhận xét: Từ bảng 3.26 và biểu đồ 3.13 cho thấy nồng độ dung dịch glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng của CPE cđ_ chitosan thu nhận từ Asp. niger là thấp nhất: 9,618 x 10 (mg/ml). Đối với CPE cđ _diatomite từ Asp. niger cho nồng độ glucose là 13,654 x 10 (mg/ml). Các CPE thương mại cho nồng độ glucose rất cao, trong đó CPE cđ _diatomite thương mại cho nồng độ glucose cao nhất là 13,754 x 2000 (mg/ml dung dịch). Lượng glucose tạo thành sau khi thủy phân tinh bột bởi CPE_TM cao hơn nhiều so với CPE từ Asp. niger vì CPE_TM có độ tinh khiết cao hơn hẳn so với CPE từ Asp. niger. CPE cđ _chitosan từ Asp. niger CPE cđ _chitosan thương mại Nồng độ glucose (mg/ml)/dd Các loại CPE cđ CPE cđ _diatomite từ Asp. niger CPE cđ _diatomite thương mại

70 3.15.2. Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein từ dung dịch thủy phân tinh bột Sau khi cô đặc dịch thủy phân bột năng thu được từ bảng 3.26 ta có dịch glucose với nồng độ xấp xỉ 5,63%. Tiến hành bổ sung thêm 2,17g glucose/100ml dung dịch để môi trường đạt nồng độ đường 12%. Tiến hành nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae thu sinh khối theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.15.2. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.27 Bảng 3.27 : Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein V canh trường (ml) Sinh khối dạng past (g) Sinh khối dạng bột (g) Hiệu suất thu nhận sinh khối dạng khô (g/l CT) TN1 TN2 TN3 TN1 TN2 TN3 450ml 17,28 17,05 17,13 6,89 6,76 6,68 13,55 TB 17,15 ± 0,117 6,78 ± 0,106 Nhận xét: Nhờ khả năng phân giải của γ-amylase trên bột năng nói riêng và tinh bột ngũ cốc nói chung, nguyên liệu rẻ tạo dung dịch glucose, có giá trị cao hơn để làm nguyên liệu nuôi nấm men Saccharomyces cerevisiae thu sinh khối giàu protein, làm cơ sở sản xuất protein đơn bào,..và các ứng dụng khác. Từ bảng 3.27 cho thấy hiệu suất thu nhận sinh khối nấm men là 23,55 (g/l canh trường nuôi). Chúng tôi nhận thấy rằng khi sử dụng dung dịch đường sau thủy phân bởi γ-amylase để nuôi nấm men, chúng ta sẽ giảm bớt được lượng đường bổ sung. Ngoài ra, chúng ta có thể sử dụng nguồn nguyên liệu tinh bột đa dạng từ các loại ngũ cốc khác để sản xuất glucose, sản xuất protein đơn bào.