Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

51 3.10. Sử dụng CPE γ-amylase thương mại Dextrozyme GA để thủy phân các loại tinh bột khác nhau 3.10.1. Sử dụng CPE γ-amylase – TM để thủy phân tinh bột tan Phương pháp dùng CPE γ-amylase thương mại được pha loãng 2000 lần để khảo sát khả năng thủy phân các loại tinh bột đã trình bày ở mục 2.2.15.2. Phương pháp xác định nồng độ glucose của dung dịch sau thủy phân đã trình bày ở mục 2.2.7. Kết quả định lượng glucose được thể hiện trong bảng 3.12 và đồ thị 3.5. Bảng 3.12: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan Cơ chất Tinh bột tan Thời gian (phút) 0 30 60 90 120 150 180 210 OD TB TN1 0,132 0,301 0,378 0,503 0,519 0,512 0,517 0,516 TN2 0,130 0,303 0,376 0,500 0,515 0,519 0,515 0,516 TN3 0,130 0,301 0,375 0,507 0,515 0,513 0,517 0,517 ∆OD 0 0,171 0,246 0,373 0,386 0,384 0,386 0,386 Nồng độ glucose (μg/mlx2000) 0 188 270 410 424 422 424 424 Thời gian (phút) Nồng độ glucose (μg/ml) Đồ thị 3.5: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bởi CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan 30 60 90 120 150 180 210

52 Nhận xét: Từ đồ thị 3.5 cho thấy nồng độ glucose tăng liên tục bắt đầu từ thời điểm xảy ra phản ứng và đạt giá trị cao nhất ở thời điểm 120 phút. Sau khi xác định nồng độ glucose không thay đổi, nhỏ 1 giọt thuốc thử Lugol vào dịch thủy phân, dung dịch không bắt màu thuốc thử. Điều này chứng tỏ CPE thương mại với hoạt độ rất cao nên đã nhanh chóng phân giải triệt để hết tinh bột tan. 3.10.2 Sử dụng CPE γ-amylase – TM để thủy phân bột năng Phương pháp dùng CPE - TM được pha loãng 2000 lần để khảo sát khả năng thủy phân các loại tinh bột đã trình bày ở mục 2.2.15.2. Phương pháp xác định nồng độ glucose của dung dịch sau thủy phân đã trình bày ở mục 2.2.7. Kết quả định lượng glucose được thể hiện trong bảng 3.13 và đồ thị 3.6. Bảng 3.13: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan Cơ chất Bột năng Thời gian (phút) 0 30 60 90 120 150 180 210 OD TB TN1 0,062 0,101 0,180 0,223 0,319 0,318 0,315 0,316 TN2 0,060 0,106 0,176 0,219 0,315 0,320 0,316 0,316 TN3 0,060 0,105 0,175 0,219 0,317 0,319 0,318 0,317 ∆OD 0 0,043 0,116 0,159 0,256 0,258 0,255 0,255 Nồng độ glucose/dd (μg/mlx2000) 0 47 128 175 281 284 280 280 Thời gian (phút) Nồng độ glucose (μg/ml) Đồ thị 3.6: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bởi CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan 30 60 90 120 150 180 210

53 Nhận xét: Từ đồ thị 3.6 cho thấy nồng độ glucose tăng dần đều bắt đầu từ thời điểm xảy ra phản ứng và đạt giá trị cao nhất ở thời điểm 120 phút. Sau khi nồng độ glucose không thay đổi, nhỏ 1 giọt thuốc thử Lugol vào dịch thủy phân, dung dịch không bắt màu thuốc thử. Điều này chứng tỏ CPE thương mại với hoạt độ rất cao nên đã nhanh chóng phân giải triệt để hết bột năng. Nhận xét: Từ đồ thị 3.7 và hiện tượng không bắt màu thuốc thử Lugol của dịch sau thủy phân từ tinh bột tan và bột năng bởi γ-amylase thương mại cho thấy lượng đường khử tạo thành từ sự thủy phân tinh bột tan nhiều hơn từ bột năng. Điều này có thể lý giải dựa trên đặc điểm cấu tạo khác nhau của tinh bột tan và bột năng. 3.11. Cố định CPE γ-amylase từ Asp. niger lên chất mang là diatomite bằng phương pháp hấp phụ và lên chất mang là chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị Phương pháp cố định đã được trình bày ở mục 2.2.12.1. 3.11.1. Hiệu suất gắn protein lên các chất mang Sau khi cố định enzyme, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein có trong dịch lọc theo phương pháp Lowry ở mục 2.2.8. Thời gian (phút) Nồng độ glucose (μg/ml) Bột năng Tinh bột tan Đồ thị 3.7: So sánh nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan và bột năng bằng CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan 30 60 90 120 150 180 210

54 Xác định hàm lượng protein ban đầu và lượng protein cố định. Sau đó, tính được hiệu suất gắn protein theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.12.3. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.14. Bảng 3.14: Lượng protein - CPE γ-amylase cố định và hiệu suất gắn protein – CPE γ-amylase lên diatomite và chitosan Vật liệu cố định E Hàm lượng protein trong dịch lọc (mg) Lượng protein ban đầu (mg) Lượng protein cố định (mg) Hiệu suất gắn protein (%) Diatomite 956,82 2171,46 1214,61 55,94 Chitosan 1912,15 2921,14 1029,01 35,22 Nhận xét: Từ bảng 3.14 chúng tôi nhận thấy khi cố định γ-amylase bằng phương pháp hấp phụ lên diatomite cho hiệu suất cố định lượng protein (55,94%) cao hơn khi cố định γ-amylase trên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị. Kết quả khảo sát này cũng phù hợp với tác giả Hoàng Bá Thanh Hải [8]. 3.11.2. Hiệu suất cố định hoạt độ CPE γ-amylase Sau khi cố định enzyme, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ E có trong dịch lọc theo phương pháp giới thiệu ở mục 2.2.7. Chúng tôi xác định tổng đơn vị hoạt độ CPE γ-amylase ban đầu, và xác định được tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase cố định. Sau đó, tính được hiệu suất cố định γ- amylase theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.12.3. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.15. Bảng 3.15: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase cố định và hiệu suất hoạt độ γ- amylase cố định. Vật liệu cố định E Tổng đơn vị hoạt độ γ- amylase trong dịch lọc (Ʃ UI) Tổng đơn vị hoạt độ CPE ban đầu (Ʃ UI) Tổng đơn vị hoạt độ CPE cố định (Ʃ UI) Hiệu suất hoạt độ CPE cđ (%) / Ʃ ban đầu Diatomite 5750,01 9600,53 3850,50 40,11 Chitosan 5942,37 8174,05 2231,08 27,30

55 Nhận xét: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase cố định bằng phương pháp hấp phụ lên diatomite là 3850.5 UI, đạt hiệu suất cố định 40,11% cao hơn hoạt độ γ-amylase cố định trên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị. Chúng tôi nhận thấy hiệu suất cố định hoạt độ CPE – γ-amylase trên chitosan trong nghiên cứu của chúng tôi là 27,30% thấp hơn so với kết quả của tác giả Hoàng Bá Thanh Hải là 41,30% [8]. Như vậy, sự cố định γ-amylase trên diatomite_chất mang vô cơ bằng phương pháp hấp phụ sẽ có hiệu quả cao hơn trên vật liệu chitosan. Hơn nữa, diatomite là vật liệu thong dụng và dễ thu nhận hơn chitosan (từ vỏ tôm cua xử lý). 3.12. Cố định CPE γ-amylase thương mại lên chất mang là diatomite bằng phương pháp hấp thụ và lên chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị Phương pháp cố định đã được trình bày ở mục 2.2.12.1. 3.12.1. Hiệu suất gắn protein lên các chất mang γ-amylase thương mại được pha loãng 2000 lần trước khi cố định. Sau khi cố định enzyme, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein có trong dịch lọc theo phương pháp Lowry ở mục 2.2.8. Xác định lượng protein ban đầu và lượng protein cố định. Sau đó, tính được hiệu suất cố định protein theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.12.3. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.16. Bảng 3.16: Lượng protein CPE γ-amylase – TM cố định và hiệu suất gắn cố định protein γ-amylase lên diatomite và chitosan. Vật liệu cố định E Hàm lượng protein trong dịch lọc (mg) Lượng protein ban đầu (mg) Lượng protein cố định (mg) Hiệu suất gắn protein (%) Diatomite 1200,69 15142,66 13941,97 92,07 Chitosan 2955,88 15151,03 12195,15 80,49 Nhận xét: Từ bảng 3.16 chúng tôi nhận thấy khi cố định γ-amylase thương mại bằng phương pháp hấp phụ lên diatomite cho hiệu suất cố định protein (92,07%) cao hơn khi cố định γ-amylase trên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị

56 (80,49%). Tương tự như trên, E _TM cố định trên diatomite (92,07%) cũng có hiệu quả cao hơn trên chitosan (80,49%). E _TM có độ tinh sạch cao hơn, do đó hiệu suất cố định cao hơn nhiều so với CPE thu nhận từ Asp. niger. 3.12.2. Hiệu suất cố định hoạt độ CPE γ-amylase thương mại γ-amylase thương mại được pha loãng 2000 lần trước khi cố định. Sau khi cố định enzyme, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ E có trong dịch lọc theo phương pháp giới thiệu ở mục 2.2.7. Xác định tổng đơn vị hoạt độ CPE γ-amylase ban đầu và tổng đơn vị hoạt độ γ- amylase cố định. Sau đó, tính được hiệu suất cố định γ-amylase theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.12.3. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.17. Bảng 3.17: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase cố định và hiệu suất cố định γ-amylase Vật liệu cố định E Hoạt độ γ- amylase trong dịch lọc (UI) Tổng đơn vị hoạt độ CPE ban đầu (Ʃ UI) Tổng đơn vị hoạt độ CPE cố định (Ʃ UI) Hiệu suất hoạt độ CPE cđ (%) Diatomite 627,69 9785,41 9157,72 93,65 Chitosan 981,87 9701,32 8719,45 89,87 Nhận xét: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase cố định trên vật liệu diatomite là 9157,72 UI, đạt hiệu suất 93,65% so với tổng hoạt độ ban đầu. Hiệu suất cố định γ- amylase trên vật liệu chitosan là 8719,45 UI, đạt hiệu suất 89,87%. Điều này có thể lý giải dựa vào độ tinh khiết cao của CPE thương mại. 3.13. Sử dụng CPE γ-amylase cố định để thủy phân các loại tinh bột khác nhau 3.13.1. Sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định để thủy phân các loại tinh bột khác nhau Phương pháp dùng CPE γ-amylase cố định lên các chất mang để khảo sát khả năng thủy phân các loại tinh bột đã trình bày ở mục 2.2.15.2. Phương pháp xác định nồng độ glucose của dung dịch sau thủy phân đã trình bày ở mục 2.2.7. Kết quả định lượng glucose được thể hiện trong bảng 3.18.

57 Bảng 3.18: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột khác nhau bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng cố định trên chất mang chitosan Cơ chất Thời gian (phút) OD TB ∆OD Nồng độ glucose (μg/mlx10)/dd TN1 TN2 TN3 Bột năng 0 0,065 0,067 0,065 0 0 30 0,127 0,127 0,126 0,061 67,78 60 0,198 0,197 0,198 0,131 145,06 90 0,265 0,263 0,263 0,198 217,58 120 0,297 0,295 0,296 0,230 253,71 150 0,298 0,298 0,295 0,231 254,21 180 0,297 0,295 0,296 0,230 254,53 210 0,295 0,297 0,298 0,231 255,39 Tinh bột tan 0 0,144 0,143 0,144 0 0 30 0,247 0,245 0,246 0,102 112,45 60 0,295 0,295 0,294 0,151 165,93 90 0,368 0,369 0,367 0,225 246,52 120 0,425 0,425 0,424 0,281 308,79 150 0,419 0,420 0,420 0,276 303,30 180 0,422 0,420 0,419 0,277 304,03 210 0,418 0,417 0,416 0,273 300,37 Nồng độ glucose (μg/ml) Bột năng Tinh bột tan 30 60 90 120 150 180 210 Thời gian (phút) Biểu đồ 3.5 : Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau khi thủy phân các loại tinh bột bởi CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan

58 Nhận xét: Từ bảng 3.18 và biểu đồ 3.5 cho thấy dưới tác dụng của CPE γ- amylase từ Asp. niger cố định trên chất mang chitosan tạo lượng glucose tỉ lệ thuận với thời gian phản ứng. Tại thời điểm 120 phút nồng độ glucose tạo thành từ thủy phân bột năng đạt giá trị cực đại là 253,71 μg/ml, còn với quá trình thủy phân tinh bột tan đạt giá trị cực đại là 308,79 μg/ml. Từ 120 phút trở lên, lượng glucose tạo thành gần như không thay đổi. Mặt khác, nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan cao hơn so với thủy phân bột năng. Ngoài ra, khi so sánh kết quả này với bảng 3.8, 3.9 chúng tôi nhận thấy rằng khi sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan để thủy phân tinh bột, hàm lượng đường khử tạo thành bằng khoảng 50% so với sử dụng CPE từ Asp. niger dạng hòa tan. Bảng 3.19: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột khác nhau bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng cố định trên chất mang diatomite Cơ chất Thời gian (phút) OD TB ∆OD Nồng độ glucose (μg/mlx10) / dd TN1 TN2 TN3 Bột năng 0 0,072 0,073 0,075 0 0 30 0,199 0,198 0,199 0,125 137,728 60 0,254 0,255 0,253 0,181 198,535 90 0,326 0,321 0,324 0,250 275,092 120 0,365 0,364 0,365 0,291 320,153 150 0,372 0,374 0,373 0,300 329,309 180 0,375 0,376 0,378 0,303 332,967 210 0,377 0,378 0,380 0,305 335,165 Tinh bột tan 0 0,145 0,142 0,144 0 0 30 0,286 0,285 0,284 0,142 155,311 60 0,348 0,350 0,348 0,206 225,275 90 0,494 0,494 0,495 0,351 385,348 120 0,652 0,650 0,650 0,507 557,143 150 0,648 0,650 0,647 0,505 554,579 180 0,647 0,646 0,645 0,502 552,014 210 0,643 0,648 0,645 0,500 551,282

59 Biểu đồ 3.6 : Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên diatomite Nhận xét: Từ bảng 3.19 và biểu đồ 3.6 cho thấy dưới tác dụng của CPE γ- amylase từ Asp. niger cố định trên chất mang diatomite tạo hàm lượng glucose tỉ lệ thuận với thời gian phản ứng. Tại thời điểm 120 phút nồng độ glucose tạo thành của dung dịch từ thủy phân bột năng đạt giá trị cực đại là 320,153 μg/ml, còn với quá trình thủy phân tinh bột tan đạt giá trị cực đại là 557,143 μg/ml. Từ 120 phút trở lên, lượng glucose tạo thành gần như không thay đổi. Mặt khác, lượng glucose tạo thành sau khi thủy phân tinh bột tan cao hơn so với thủy phân bột năng. Ngoài ra, khi so sánh kết quả này với bảng 3.8, 3.9 chúng tôi nhận thấy rằng khi sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên diatomite để thủy phân bột năng, hàm lượng đường khử tạo thành bằng khoảng 60% so với sử dụng CPE từ Asp. niger dạng hòa tan. Trong trường hợp thủy phân tinh bột tan bằng γ-amylase từ Asp. niger cố định trên diatomite, hàm lượng đường khử tạo thành bằng khoảng 92% so với sử dụng CPE γ-amylase cố định từ Asp. niger dạng hòa tan. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi so với tác giả Hoàng Bá Thanh Hải [8] khi sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên các chất mang alginat canxi, kaolin, chitosan nói chung, hàm lượng đường khử tạo thành bằng khoảng 80% so với khi sử dụng CPE từ Asp. niger dạng hòa tan để thủy phân tinh bột. Kết quả nghiên cứu này cũng tương đối phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi ở trên. Nồng độ glucose (μg/ml) Bột năng Tinh bột tan 30 60 90 120 150 180 210 Thời gian (phút)

60 3.13.2. Sử dụng CPE γ-amylase thương mại cố định để thủy phân các loại tinh bột khác nhau Phương pháp dùng CPE γ-amylase thương mại cố định để khảo sát khả năng thủy phân các loại tinh bột đã trình bày ở mục 2.2.15.2. Phương pháp xác định nồng độ glucose của dung dịch sau thủy phân đã trình bày ở mục 2.2.7. Kết quả định lượng glucose được thể hiện trong bảng 3.20 và biểu đồ 3.7. Bảng 3.20: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột khác nhau bằng CPE γ-amylase thương mại cố định trên chất mang chitosan Cơ chất Thời gian (phút) OD TB ∆OD Nồng độ glucose (μg/mlx2000)/dd TN1 TN2 TN3 Bột năng 0 0,065 0,065 0,065 0 0 30 0,302 0,303 0,305 0,238 261,905 60 0,448 0,447 0,447 0,382 420,146 90 0,603 0,605 0,603 0,539 591,942 120 0,605 0,606 0,605 0,540 593,773 150 0,604 0,604 0,606 0,540 593,041 180 0,606 0,603 0,604 0,541 592,674 210 0,612 0,615 0,613 0,548 613,910 Tinh bột tan 0 0,142 0,144 0,144 0 0 30 0,463 0,465 0,465 0,321 352,747 60 0,548 0,547 0,544 0,403 442,857 90 0,673 0,677 0,675 0,532 584,249 120 0,680 0,682 0,682 0,538 591,209 150 0,685 0,682 0,683 0,540 592,675 180 0,685 0,684 0,681 0,544 580,220 210 0,690 0,688 0,685 0,543 598,168