Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

41 tổng hợp γ- amylase của nấm mốc Asp.niger với hai loại cơ chất cảm ứng là bột bắp và bột năng. 3.4.1.1. Ảnh hưởng thành phần môi trường khi cơ chất cảm ứng là bột bắp γ-amylase từ các môi trường nuôi Asp. niger được xác định hoạt độ với sự thay đổi tỷ lệ giữa cám gạo và bột bắp trong thành phần môi trường nuôi cấy theo các tỉ lệ 74/1 (g); 73/2 (g); 72/3 (g); 71/4 (g); 70/5 (g). Phương pháp nuôi cấy và thu nhận CPE được trình bày ở mục 2.2.5.2. và 2.2.6. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và biểu đồ 3.1. Bảng 3.2: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột bắp Tỷ lệ cám gạo/bột bắp (gram) OD 0 OD T ∆OD Nồng độ glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/gMT) TN 1 TN 2 TN 3 TN 1 TN 2 TN 3 74/1 0,468 0,477 0,465 0,713 0,698 0,708 0,235 4706 2118 73/2 0,614 0,643 0,659 0,920 0,983 0,958 0,315 6300 3780 72/3 0,785 0,800 0,811 1,070 1,094 1,073 0,280 5606 4205 71/4 1,040 1,062 1,034 1,498 1,492 1,470 0,435 8693 6085 70/5 0,714 0,743 0,658 1,043 1,056 1,025 0,336 6726 4036 Biểu đồ 3.1: Hoạt độ γ-amylase từ các môi trường nuôi Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột bắp Nhận xét: Hoạt độ γ-amylase thu được từ canh trường nuôi cấy Asp. niger có tỷ lệ cám gạo/bột bắp ≈ 71/4 (g) là cao nhất: 6085 (UI/gMT). Như vậy, khi bổ sung Tỷ lệ cám gạo/bột bắp Hoạt độ (UI/gCT) 73/ 74/ 72/ 71/ 70/

42 vào môi trường nuôi nấm mốc cơ chất cảm ứng là bột bắp với tỉ lệ 4% chúng ta thu được hoạt độ γ-amylase là cao nhất. 3.4.1.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường khi cơ chất cảm ứng là bột năng Enzyme γ-amylase từ các canh trường Asp. niger được xác định hoạt độ với sự thay đổi tỷ lệ giữa cám gạo và bột năng trong thành phần môi trường nuôi cấy theo các tỉ lệ 74/1 (g); 73/2 (g); 72/3 (g); 71/4 (g); 70/5 (g). Phương pháp nuôi cấy và thu nhận CPE được trình bày ở mục 2.2.5.2. và 2.2.6. Kết quả được trình bày trong bảng 3.3 và biểu đồ 3.2. Bảng 3.3: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột năng Tỷ lệ cám gạo/bột năng (gram) OD 0 OD T ∆OD Nồng độ glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/gMT) TN 1 TN 2 TN 3 TN 1 TN 2 TN 3 74/1 0,491 0,447 0,448 0,654 0,609 0,605 0,161 3213 1981 73/2 0,746 0,728 0,718 0,917 0,938 0,933 0,199 3973 2582 72/3 0,474 0,497 0,418 0,772 0,765 0,683 0,277 5540 3324 71/4 0,619 0,616 0,650 1,020 1,014 1,023 0,396 7813 5209 70/5 0,394 0,335 0,332 0,598 0,540 0,539 0,205 4106 3080 Biểu đồ 3.2 : Hoạt độ γ-amylase từ các môi trường nuôi Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột năng Nhận xét: Hoạt độ γ-amylase thu được từ môi trường nuôi cấy Asp. niger có tỷ lệ cám gạo/bột năng ≈ 71/4 (g) là cao nhất: 5209 (UI/gCT). Như vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi nấm mốc cơ chất cảm ứng là bột năng với tỉ lệ 4% chúng ta thu được hoạt độ γ-amylase là cao nhất. Tỷ lệ cám gạo/bột bắp Hoạt độ (UI/gCT) 74/ 73/ 72/ 71/ 70/

43 Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của 2 loại môi trường nuôi cấy nấm mốc Asp. niger đến hoạt độ γ-amylase Nhận xét: Từ biểu đồ 3.3 cho thấy hoạt độ γ-amylase tăng dần bắt đầu từ tỉ lệ cám gạo/bột bắp (bột năng) 73/2 (g) và đạt giá trị hoạt độ cao nhất ở tỷ lệ 71/4, trong đó hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột bắp có giá trị cao nhất là 6085 (UI/gCT). Tuy nhiên, hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột năng cũng có giá trị gần tương đương bột bắp là 5209 (UI/gCT). Vì bột năng có giá thành rẻ hơn bột bắp và cho hoạt độ γ-amylase cũng rất cao nên chúng tôi chọn CPE γ-amylase thu nhận từ canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là bột năng để tiến hành tiếp các thí nghiệm sau. 3.4.2. Hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy Từ kết quả thu được ở phần 3.4.1 chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt độ γ- amylase từ canh trường Asp. niger tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau với cùng thành phần môi trường có tỷ lệ cám gạo/bột năng là 71/4 (g) bằng phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.5.1. và 2.2.6. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4 và biểu đồ 3.4. Hoạt độ (UI/gCT) Tỷ lệ cám gạo/tinh bột 74/ 73/ 72/ 71/ 70/ Bột bắp Bột năng

44 Bảng 3.4: Hoạt độ γ-amylase từ môi trường nuôi Asp. niger theo thời gian nuôi cấy Nhận xét: Hoạt độ γ-amylase thu được từ môi trường nuôi cấy Asp. niger tại thời điểm 60 giờ đạt giá trị cao nhất là 7046 (UI/gCT). Sau đó, khi bào tử ngày càng nhiều và già đi tương ứng với sự giảm đều hoạt độ γ-amylase tại các thời điểm tiếp theo là 72h, 84h và 96h ≈ các trị số 3740, 3604, 2610 (UI/gCT). Như vậy, khi môi trường nuôi cấy vừa chớm xuất hiện bào tử sẽ tạo 3.5. Nuôi cấy nấm mốc theo điều kiện tối ưu tuyển chọn về thời gian và thành phần môi trường chất cảm ứng Từ kết quả thu được ở bảng 3.2, 3.3, 3.4 tiến hành nuôi cấy chủng Asp. niger với thời gian và môi trường tối ưu. Sau đó, thu nhận CPE γ-amylase với tác nhân tủa là ethanol 96 o theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.6 và tiến hành xác định hoạt độ CPE γ-amylase thu được theo phương pháp 2.2.7. Thời gian (giờ) OD 0 OD T ∆OD Nồng độ glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/gCT) TN 1 TN 2 TN 3 TN 1 TN 2 TN 3 48 0,919 0,919 0,950 1,357 1,314 1,283 0,397 7940 4896 60 0,965 0,965 0,969 1,511 1,490 1,524 0,542 10840 7046 72 0,845 0,769 0,771 1,170 1,047 1,103 0,312 6233 3740 84 0,696 0,647 0,637 0,913 0,908 0,916 0,269 5380 3604 96 0,502 0,640 0,564 0,693 0,698 0,697 0,174 3480 2610 48 Thời gian (giờ) Hoạt độ (UI/gCT) Biểu đồ 3.4: Hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy 60 72 84 96

45 Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 Bảng 3.5: Hoạt độ chung của CPE γ-amylase từ canh trường Asp. niger Tỷ lệ V ddE / V ethanol Thí nghiệm Hệ số pha loãng OD 0 OD T (λ = 530nm) Hoạt độ (UI/g M T) Ống 1 Ống 2 Ống 3 ∆OD TB 1/4 1 10 0,550 1,070 1,094 1,080 0,529 66,21 ±1,595 2 10 0,515 1,044 1,094 1,026 3 10 0,557 1,055 1,100 1,060 Nhận xét: Với tỉ lệ V ddE /V ethanol ≈ ¼ thu được hoạt độ E khá cao là 66,21 (UI/gMT). So với nghiên cứu của tác giả [8] thì giá trị này cũng phù hợp. 3.6. Thu nhận CPE γ-amylase từ môi trường Asp. niger trên môi trường bán rắn (trong điều kiện tối ưu trên) Phương pháp tiến hành được trình bày ở mục 2.2.6 Hiệu suất thu nhận = Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 Bảng 3.6: Hiệu suất thu nhận CPE γ-amylase từ canh trường Asp. niger Tỷ lệ V ddE / V ethanol Mẫu thí nghiệm Trọng lượng canh trường (g) Trọng lượng CPE γ-amylase (g) Hiệu suất thu nhận CPE/CT (%) 1/4 1 30 1,717 5,57% ± 0,048 2 30 1,621 3 30 1,675 TB 30 1,671 Nhận xét: Với tỉ lệ V ddE /V ethanol ≈ ¼ thì hiệu suất thu nhận CPE γ-amylase từ môi trường nuôi cấy Asp. niger là 5,57%. So với nghiên cứu của tác giả [8] thì giá trị này cũng phù hợp. Khi sấy khô tuyệt đối 10g canh trường ban đầu được 3.95g canh trường khô. Từ đó, chúng tôi xác định được hàm ẩm CPE: w = 3,95 100 39,5% 10 x = 3.7. Hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger x 100%

46 3.7.1. Hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Lowry được trình bày ở mục 2.2.8 Tính kết quả dựa vào đồ thị chuẩn ở phụ lục 5.2 Kết quả xác định hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger với tác nhân tủa là ethanol 96 o được thể hiện ở bảng 3.7. Bảng 3.7: Hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger Tỷ lệ V ddE / V ethanol Thí nghiệm Hệ số pha loãng OD 0 OD T (λ = 750nm) Hàm lượng protein (mg/g CPE) Ống 1 Ống 2 Ống 3 ∆OD tr.bình 1/4 1 10 0,022 0,103 0,113 0,102 0,076 111,11 ± 8,211 2 10 0,029 0,103 0,100 0,102 3 10 0,027 0,101 0,105 0,105 Nhận xét: Với tỉ lệ V ddE /V ethanol ≈ ¼, hàm lượng protein thu được đạt 111,11mg/gCPE. 3.7.2. Hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger Từ các kết quả thu được trong bảng 3.6, 3.7 tiến hành xác định hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger với tác nhân tủa là ethanol 96 o theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.2.9. CPE CPE UI HđC / g HđR mg_ protein _ E / g mg _ protein _ E = = ∑ = 66,21 111,11 = 0,596 (UI/mg_protein_E) 3.8. Sử dụng CPE γ-amylase hòa tan từ canh trường Asp. niger để thủy phân các loại tinh bột khác nhau

47 Phương pháp dùng CPE γ-amylase pha loãng 10 lần để khảo sát khả năng thủy phân các loại tinh bột đã trình bày ở mục 2.2.15.2. Nồng độ glucose của dung dịch sau thủy phân đã trình bày ở mục 2.2.7. Kết quả định lượng glucose được thể hiện trong bảng 3.8, 3.9 và đồ thị 3.2, 3.3. Bảng 3.8: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan Cơ chất Tinh bột tan Thời gian (phút) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 OD TB TN1 0,136 0,213 0,299 0,354 0,437 0,548 0,678 0,685 0,680 0,685 TN2 0,138 0,231 0,327 0,412 0,509 0,582 0,669 0,690 0,692 0,697 TN3 0,136 0,220 0,321 0,398 0,500 0,576 0,680 0,684 0,693 0,688 ∆OD 0 0,085 0,179 0,251 0,345 0,432 0,539 0,550 0,552 0,553 Nồng độ glucose(μg/mlx10) 0 93 197 277 380 475 592 604 606 607 Đồ thị 3.2: Nồng độ glucose của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan Nhận xét: Từ đồ thị 3.2 cho thấy lượng đường khử tăng nhanh dần từ thời điểm 60 phút và đạt giá trị hoạt độ cao nhất ở thời điểm 180 phút. Sau khi hàm lượng glucose không thay đổi, nhỏ 1 giọt thuốc thử Lugol vào dịch thủy phân, có sự thay đổi màu sắc từ trắng đục sang màu đỏ nhẹ. Điều này chứng tỏ các trung tâm phản ứng của Thời gian (phút) Nồng độ glucose (μg/ml) 30 60 90 120 150 180 210 240 270

48 E đã bão hòa nên chưa phân giải triệt để hết tinh bột tan, vì màu đỏ nhạt chứng tỏ có sự hiện diện của amilopectin trong cấu tạo của tinh bột. Bảng 3.9: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng CPE γ-amylase Asp. niger dạng hòa tan Cơ chất Bột năng Thời gian (phút) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 OD TB TN1 0,060 0,149 0,202 0,270 0,324 0,437 0,470 0,487 0,490 0,493 TN2 0,060 0,147 0,211 0,304 0,358 0,424 0,469 0,513 0,510 0,520 TN3 0,065 0,152 0,230 0,288 0,345 0,450 0,502 0,520 0,518 0,520 ∆OD 0 0,088 0,153 0,238 0,281 0,369 0,419 0,445 0,444 0,449 Nồng độ glucose (μg/mlx10) 0 96 168 261 309 412 460 489 488 493 Đồ thị 3.3: Nồng độ glucose của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng CPE γ- amylase Asp. niger dạng hòa tan Nhận xét: Từ đồ thị 3.3 cho thấy lượng glucose tăng nhanh dần từ thời điểm 60 phút và đạt giá trị cao nhất ở thời điểm 210 phút. Sau khi hàm lượng glucose không thay đổi, nhỏ 1 giọt thuốc thử Lugol vào dịch thủy phân, có sự thay đổi màu sắc từ trắng đục sang màu xanh tím nhạt đặc trưng của tinh bột bắt màu Lugol. Điều này chứng tỏ các trung tâm phản ứng của E đã bão hòa nên chưa phân giải triệt để hết bột năng. Thời gian (phút) Nồng độ glucose (μg/ml) 30 60 90 120 150 180 210 240 270

49 Đồ thị 3.4: So sánh nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan và bột năng bằng CPE γ- amylase Asp. niger dạng hòa tan Nhận xét: Từ đồ thị 3.4 và sự thay đổi màu sắc khác nhau của dịch sau thủy phân từ tinh bột tan và bột năng bởi γ-amylase cho thấy lượng đường khử tạo thành từ sự thủy phân tinh bột tan vừa nhanh hơn vừa nhiều hơn. Điều này có thể lý giải dựa trên đặc điểm cấu tạo khác nhau của tinh bột tan và bột năng. Tinh bột tan thực chất là tinh bột đã thủy phân một phần tạo dạng dextrin nên dễ thủy phân hơn. 3.9. Xác định hoạt độ riêng γ-amylase thương mại Dextrozyme theo phương pháp so màu DNS 3.9.1. Xác định hoạt độ chung CPE - TM theo phương pháp so màu DNS Tiến hành xác định hoạt độ chung CPE γ-amylase thương mại Dextrozyme theo phương pháp 2.2.7. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10. Bảng 3.10: Hoạt độ chung của CPE – TM (UI/g_CPE) Thí nghiệm Hệ số pha loãng OD 0 OD T (λ = 530nm) Hoạt độ CPE – TM (μg/ml_CPE) Ống 1 Ống 2 Ống 3 ∆OD 1 2000 0,156 0,656 0,656 0,658 0,498 435 ± 2,56 2 2000 0,157 0,658 0,650 0,655 3 2000 0,160 0,655 0,656 0,656 Thời gian (phút) Nồng độ glucose (μg/ml) Bột năng Tinh bột tan 30 60 90 120 150 180 210 240 270

50 3.9.2. Xác định hàm lượng protein của CPE - TM theo phương pháp Lowry Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Lowry được trình bày ở mục 2.2.8 Tính kết quả dựa vào đồ thị chuẩn ở mục 3.4.3.1 Kết quả xác định hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thương mại được thể hiện ở bảng 3.11. Bảng 3.11: Hàm lượng protein trong CPE - TM Thí nghiệm Hệ số pha loãng OD 0 OD T (λ = 750nm) Hàm lượng protein (μg/ml CPE-TM) Ống 1 Ống 2 Ống 3 ∆OD 1 2000 0,031 0,103 0,103 0,102 0,074 87,07 ± 0,58 2 2000 0,032 0,107 0,108 0,107 3 2000 0,032 0,108 0,105 0,105 3.9.3. Xác định hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thương mại Từ các kết quả thu được trong bảng 3.10, 3.11 tiến hành xác định hoạt độ riêng của CPE - TM theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.2.9. CPE CPE HđC / g HđR mg_protein_E/g = = = 4,99 (UI/mg_protein_E) Với: + HđR: hoạt độ riêng. + HđC: hoạt độ chung. + ∑ĐVHđ: Số đơn vị hoạt độ enzyme/g CPE hay /ml CPE (∑UI/g) + C: mg protein/ml dung dịch enzyme hay /g CPE. + CPE: chế phẩm enzyme + UI: đơn vị hoạt độ enzyme.