Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

23 1.5.3. Các phương pháp thủy phân tinh bột [1][10] Một tính chất quan trọng của tinh bột là quá trình thủy phân liên kết α-D (1,4); (1,6)…- glycoside giữa các đơn vị glucose bằng acid hoặc bằng enzyme. Đặc trưng của phản ứng này là sự giảm nhanh độ nhớt và sinh ra đường. 1.5.3.1. Thủy phân tinh bột bằng acid [10][32] Dưới tác dụng của axit một phần các liên kết giữa các phân tử và trong phân tử tinh bột bị đứt, làm giảm kích thước phân tử, tinh bột thu được những tính chất mới. Acid được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất dextrin, maltodextrin và một vài loại siro có đương lượng dextro (dextrose equivalent - DE) khoảng 40. Sản phẩm có DE thấp thường bị thoái hóa do thủy phân không hoàn toàn, còn sản phẩm DE cao hơn lại có độ ổn định màu và vị kém. Sự thủy phân tinh bột bằng acid đã được sử dụng rộng rãi trong quá khứ. Nhưng hiện nay gần như được thay thế bằng các quá trình thủy phân bằng E. Vì sử dụng acid đòi hỏi các vật liệu chống ăn mòn, tăng độ màu và hàm lượng muối trong sản phẩm, cần nhiều năng lượng để nâng nhiệt độ phản ứng và tương đối khó kiểm soát. Ngoài ra, các acid mạnh dùng trong thủy phân không thân thiện với môi trường và gây nhiều khó khăn cho xử lí nước thải. 1.5.3.2. Thủy phân tinh bột bằng enzyme [11][33] Tinh bột có thể bị thủy phân bởi hệ E đặc hiệu với liên kết α-1,4 như hệ enzyme amylase; hay bởi các enzyme đặc hiệu với liên kết α-1,6 như pululanase,…; hay bởi các enzyme đặc hiệu với liên kết α-1,6 và liên kết α-1,4 như γ-amylase,… Trong sản xuất công nghiệp các đặc điểm và các tính chất của các sản phẩm thường phụ thuộc vào nguồn E được sử dụng, nồng độ E và thời gian thủy phân. Quá trình thủy phân tinh bột từ E vi sinh vật tạo dung dịch đường có thể chia làm 3 giai đoạn theo sơ đồ:

24 1.5.4. Các sản phẩm thủy phân tinh bột và ứng dụng [14] Hiện nay, nấm mốc được dùng phổ biến để thu chế phẩm amylase đường hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột trong sản xuất rượu, bia, sinh khối nấm men, … Trong công nghệ sản xuất sinh khối nấm men, sản phẩm thu được là những tế bào chứa hàm lượng protein rất cao (40-60%), đồng thời còn chứa lượng không nhỏ các chất béo, vitamin và các chất khoáng. Đặc biệt, protein vi sinh vật theo hàm lượng axit amin, vitamin và mức độ hấp thụ còn vượt trội hơn nguồn protein động vật. Vì vậy, việc dùng sinh khối nấm men khô làm nguồn protein-vitamin bổ sung trong khẩu phần thức ăn chăn nuôi gia súc và gia cầm đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn. Sản phẩm này thường được gọi là Men gia s úc hay Men thức ăn chăn nuôi, hay nguồn protein đơn bào (SCP) có ý nghĩa rất quan trọng đối với ngành kinh tế quốc dân. Quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men từ sản phẩm đường hóa nguồn nguyên liệu tinh bột nhờ Asp. niger được tóm tắt theo sơ đồ sau: Hình 1.4: Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi E vi sinh vật [14] Tinh bột Dextrin hóa α - amylase Glucoamylase β - amylase Pululanase Oligosaccharid, maltose, α - glucose Đường hóa Dextrin mạch thẳng và mạch nhánh Glucoisomerase Fructose Đồng phân hóa

25 Hình 1.5: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men[14] Asp. niger Tinh bột α - glucose γ - amylase Nhân giống Nấm men D-glucose, các muối vô cơ Li tâm Nuôi thu sinh khối Môi trường dinh dưỡng Xử lý Sinh khối Thải bỏ Sấy khô Thành phẩm

Phaàn 2 Vaät lieäu – Phöông phaùp

26 PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu - Vi sinh vật: Nấm mốc Asp. niger từ Bộ môn Sinh hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. HCM. Nấm men Saccharomyces cerevisiae thương phẩm (Hãng Angel, Trung Quốc). - Enzyme: γ-amylase hòa tan thương phẩm (Hãng Novo Đan mạch). - Cơ chất: Bột năng (mua tại các chợ trong thành phố) và tinh bột tan (phòng thí nghiệm sinh hóa trường Đại học KHTN cung cấp). - Chất mang vô cơ diatomite (celite) và hữu cơ chitosan (phòng thí nghiệm sinh hóa trường Đại học KHTN cung cấp). 2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm do phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm, Tp. HCM và phòng thí nghiệm Sinh hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp giữ giống Asp. niger [20] * Nguyên tắc Nấm mốc Asp. niger có khả năng sinh bào tử nên có thể giữ giống bằng cách cấy trên môi trường thạch nghiêng PGA (Potato glucose agar). * Môi trường PGA gồm: Khoai tây: 100g; Glucose: 10g; Agar: 10g; Nước cất: 500ml; pH = 6.5; Hấp khử trùng 121 0 C, 15 phút. * Cách tiến hành: - Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng và nấu chín. - Chiết dịch nấu khoai tây, nếu dịch có quá nhiều tinh bột phải lọc qua vải lọc.

27 - Cho agar vào dịch đang đun, khuấy liên tục cho đến khi agar tan hoàn toàn, tiếp tục cho glucose vào, khuấy đều cho tan rồi đổ vào các ống nghiệm, đậy nút bông, hấp khử trùng. Sau đó, đặt nghiêng các ống nghiệm tạo thạch nghiêng. - Cấy chuyền từ ống giống sang các ống thạch nghiêng, nuôi ở t 0 = 30-35 0 C trong 2-3 ngày cho bào tử mọc đều bề mặt thạch nghiêng, bảo quản ở t 0 = 5-9 0 C. 2.2.2. Quan sát các đặc điểm hình thái của chủng giống Asp. niger [12][20] 2.2.2.1. Quan sát đại thể [12][20] Sau khi hoạt hóa giống ta tiến hành tạo khuẩn lạc khổng lồ theo các bước sau: - Chuẩn bị môi trường Czapek Dox cải tiến (gồm : 1,5g KH 2 PO 4 ; 3,5g NaNO 3 ; 20g glucose; 0,5g KCl; 0,5g MgSO 4 .7H 2 O; 0,1g FeSO 4 .7H 2 O; 20g agar; 1000ml nước cất; khử trùng 121 0 C, 1atm, 15 phút) đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng 3mm. - Dùng que cấy lấy bào tử từ ống giống thạch nghiêng rồi cấy chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. - Nuôi cấy ở nhiệt độ 30 0 C trong khoảng 7 ngày. - Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm: hình thái, kích thước, màu sắc khuẩn lạc, dạng sợi nấm mọc ở trên mặt thạch, đặc điểm mép khuẩn lạc, … 2.2.2.2. Quan sát vi thể bằng kĩ thuật làm phòng ẩm[20] - Chuẩn bị môi trường Czapek Dox cải tiến đổ vào 2-3 đĩa petri dày khoảng 1mm. Khi thạch đã đông, dùng khoan nút chai vô trùng có d ≈ 9mm khoan các khối thạch. - Chuẩn bị các đĩa petri sạch, lame, lamelle, giấy thấm vô trùng. - Đặt khối thạch lên lame. Cấy một ít bào tử nấm mốc lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lamelle lại và cho vào hộp petri có sẵn giấy thấm được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. - Sau 2-3 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng 30 – 32 0 C, gỡ lamelle ra, úp lên một lame sạch khác. Gỡ bỏ khối thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lamelle lên trên ta được tiêu bản để quan sát các đặc điểm hình

28 thái nấm sợi ở vật kính x40: giá bào tử thể, thể bình, cuống thể bình, sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn, đặc điểm bào tử,… 2.2.3. Phương pháp định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu [9][12][20] * Cấu trúc buồng đếm Buồng đếm Goriaep là một phiến kính dày hình chữ nhật, ở phần giữa là lõm phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 4,5 hình vuông có diện tích tổng cộng là 1mm 2 và được chia thành 25 ô vuông lớn (1/25 mm 2 / 1 ô). Mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm 2 , mỗi ô lớn có thể tích là 4.10 -6 ml. * Cách tiến hành Lắc mạnh dịch huyền phù, dùng pipetman nhỏ một giọt dịch huyền phù lên bề mặt khung đếm. Đặt khung đếm lên bàn kính hiển vi. Đếm ít nhất 5 ô lớn, lấy trị số trung bình (không quá 10 tế bào/1 ô nhỏ ≈ 2.5 < a <10). * Cách tính kết quả: Số tế bào trên 1ml mẫu phân tích (N): N (tế bào/ml) = Trong đó: a: số tế bào trung bình có trong một ô lớn. v: thể tích một ô lớn = 4 x 10 4 . K: hệ số pha loãng mẫu. Vậy N (tế bào/ml) = = 0.25 x a x K x 10 6 . * Định lượng tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang a/ Nguyên tắc Tế bào VSV là 1 thực thể nên khi hiện diện trong môi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới và làm đục môi trường. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào 1 cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sóng 610nm.

29 b/ Cách tiến hành Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách: - Pha loãng 1 huyền phù chứa bào tử nấm mốc cần kiểm nghiệm có mật độ bất kì thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD610nm đạt các giá trị lân cận 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5. Đo OD610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế. - Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (dùng khung đếm hồng cầu), xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này. - Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log (N/ml) theo OD610nm. * Xác định mật độ tế bào theo độ đục - Đo độ đục của 1 huyền phù tế bào cần xác định mật độ. - Từ trị số OD610nm đo được, suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml (N/ml = 10 a với a= log(N/ml)) từ đường chuẩn. 2.2.4. Phương pháp khảo sát thời gian nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy Asp. niger thu γ – amylase [8] * Môi trường nuôi cấy: Cám: 70% - 75%; Trấu: 25%; Bột năng (hay bột bắp): 1 - 5%. * Dung dịch khoáng bổ sung vào môi trường tạo độ ẩm 50% gồm: NaNO 3 : 3g; K 2 HPO 4 : 1g; MgSO 4 : 0.5g; KCl: 0.5g; FeSO 4 : 0.1g; Nước cất: 1000ml; Khử trùng 121 0 C, 1atm, 15 phút. * Cách tiến hành - Hỗn hợp cám, trấu, bột năng (hay bột bắp) sau khi bổ sung dung dịch khoáng được trộn đều rồi chia đều vào các erlen, bịt bông gòn. - Dùng pipet hút 1 ml dung dịch huyền phù nấm mốc cấy vào mỗi erlen (30g môi trường/1 erlen) (lượng bào tử cho vào khoảng 15x10 7 ). - Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng dùng tay lắc đều môi trường để giữ độ xốp và thoáng khí.

30 2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp γ – amylase từ Asp. niger [3][7][9] 2.2.5.1. Thời gian nuôi cấy - Tại mỗi thời điểm nuôi cấy (2; 2,5; 3; 3,5; 4 ngày), lấy 10g môi trường nuôi cấy nấm mốc hòa trong 20 ml nước cất, để trên máy lắc 30 phút, nghiền rồi lọc qua vải, sau đó li tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. - Thu lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc, thu dịch E thô. - Pha loãng dịch E thô lần lượt 10 lần, 50 lần, 100 lần tùy vào thời điểm cần khảo sát hoạt độ. - Tiến hành phản ứng xác định hoạt độ E theo từng thời điểm nuôi cấy theo mục 2.2.7. - Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến đổi của hoạt độ γ – amylase theo thời gian nuôi cấy khác nhau của chủng nấm mốc Asp. niger. 2.2.5.2. Thành phần môi trường thay đổi - Lần lượt thay đổi tỷ lệ cám gạo và bột năng (hay bột bắp) trong thành phần môi trường nuôi cấy theo các tỉ lệ: 75/1; 74/2; 73/3; 72/4; 71/5 (gram). - Tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt độ γ – amylase theo sự thay đổi thành phần môi trường của nấm mốc Asp. niger theo mục 2.2.4, 2.2.6 và 2.2.7. 2.2.6. Phương pháp thu nhận γ – amylase từ Asp. niger [9][14][25] - Nuôi cấy nấm mốc trong khoảng thời gian và môi trường tối ưu. - Tách chiết, thu nhận chế phẩm E bán tinh khiết được thực hiện bằng cách sau: Môi trường nuôi nấm mốc được khuấy trộn với nước cất (tỷ lệ nước cất và môi trường là 2:1), lọc qua vải lọc lấy dịch lọc, thu được phần dịch chứa E. Làm lạnh nhanh dịch chiết E xuống còn 3-5 0 C, kết tủa E bằng cồn theo tỷ lệ 4 cồn : 1 dịch enzyme (cồn cũng đã được làm lạnh 3-5 0 C). Ly tâm dịch tủa trong 15 phút ở tốc độ

31 6000 vòng/phút. Thu tủa, sấy ở nhiệt độ 35-40 0 C cho đến khi độ ẩm của tủa đạt 11- 14%. Thu được chế phẩm E khô. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh. 2.2.7. Xác định hoạt độ γ – amylase theo phương pháp so màu với DNS [9] 2.2.7.1. Nguyên tắc Hoạt độ γ – amylase (gluco-amylase) được tính dựa trên lượng glucose tạo ra khi thủy phân tinh bột bằng enzyme. Hàm lượng glucose được xác định bằng cách đo mật độ quang của dung dịch tạo màu khi có mặt thuốc thử DNS (3, 5 dinitro salicilic acid) tại bước sóng 530nm. Một đơn vị hoạt tính γ – amylase xúc tác thủy phân tinh bột, giải phóng 1 μg glucose trong 1 phút, ở điều kiện nhiệt độ 45 0 C, pH 5. 2.2.7.2. Cách tính HđC = Với: m: Hàm lượng glucose (μg/ml). L: Độ pha loãng mẫu. 5: Thể tích dung dịch phản ứng (ml). t: thời gian phản ứng (10 phút). HđC: hoạt độ chung γ – amylase (UI/g_CPE). 2.2.8. Định lượng protein hòa tan trong CPE theo phương pháp Lowry [12][26] Phương pháp này dùng để xác định lượng protein hòa tan có trong 1 gram chế phẩm enzyme (hay 1ml chế phẩm enzyme lỏng), từ đó xác định hoạt tính riêng của enzyme trên 1mg protein enzyme. Phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng protein trong các nguyên liệu khác. 2.2.8.1. Nguyên tắc Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng loại với nhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau. m. L. 5 t