Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ Amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

13 1.3.2.3. Nguồn nguyên liệu thu nhận [35][39] Những chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cao γ-amylase được sử dụng trong công nghiệp là: Asp. ni ger, Asp. awamori, Asp. usamii, …Các vi sin h vật khác cũng có tổng hợp γ-amylase nhưng lượng nhỏ hơn. 1.4. Enzyme cố định (immobilized enzyme) 1.4.1. Khái quát sự cố định E [19] Enzyme cố định (hay còn được gọi là E không tan) là E có sự tham gia hoạt động trong không gian bị giới hạn. Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoạt của E bằng cách gắn nó vào một pha cách ly, tách rời khỏi pha lỏng tự do và ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với các phân tử cơ chất, chất hoạt hóa (effector) hay chất ức chế (inhibitor). Pha gắn E thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưa nước. 1.4.2. Vật liệu cố định enzyme [19] Không có vật liệu cố định nào thích hợp cho tất cả các loại E và cũng không có E nào thích hợp với tất cả các loại vật liệu cố định. Vì vậy, việc nghiên cứu đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định là cần thiết cho sự chọn lựa phương pháp cố định E. Vật liệu cố định E và tế bào có thể được chia thành hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu cơ. 1.4.2.1. Vật liệu vô cơ [16][5] Vật liệu vô cơ thường rất bền với môi trường xung quanh, có cấu tạo dạng xốp, nhiều lỗ nên dễ hấp phụ E, nhất là với phương pháp hấp phụ vật lý. Các vật liệu vô cơ thông dụng như bột thủy tinh, silicagel, các oxyt kim loại như oxyt nhôm, oxyt magie,…Trong đó, có một vật liệu bền, rẻ tiền và dễ kiếm được ứng dụng phổ biến trong sản xuất công nghiệp là diatomite, tên thương mại là celite. 1.4.2.2. Vật liệu hữu cơ [19][21]

14 Vật liệu hữu cơ dùng làm chất mang để cố định E được chia làm hai loại là polymer sinh học và polymer tổng hợp hóa học. Chúng thường có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH 2 , -COOH, -OH, -SH,…nên dễ kết gắn với E nhưng độ bền với tác động môi trường không cao, đặc biệt với các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công. Một số chất mang là polymer sinh học sử dụng rộng rãi hiện nay là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng. Ngoài ra, chitin, chitosan cũng được xem là những vật liệu đầy hứa hẹn cho cố định E và tế bào vì rất phổ biến trong tự nhiên, rẻ tiền, là vật liệu có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, tạo gen, kháng khuẩn tốt, có sự hiện diện một lượng lớn các nhóm chức tự nhiên là –NH 2 . Chitosan có thể cố định E bằng phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt E, nhốt tế bào trong gel chitosan. Tuy nhiên, chitin và chitosan có tính chất kị nước, độ trương và diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ nên hạn chế khả năng tiếp xúc của cơ chất với E cđ , đặc biệt trong trường hợp cơ chất có khối lượng phân tử lớn. Nếu khắc phục được nhược điểm này thì chitin và chitosan sẽ là những vật liệu lý tưởng đầy hứa hẹn cho cố định E và tế bào. Chất mang là polymer tổng hợp hóa học cũng khá phong phú như polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polystyren, polyethylen ghép với vinyl monomer,…Nhóm chất mang này có ưu điểm chung là bền, có tính chất cơ lý tốt, kháng khuẩn tốt, độ trương tốt, một trong số chúng còn có khả năng điều chỉnh được kích thước lỗ. Bên cạnh đó, chúng còn tồn tại một số nhược điểm nhất định như là giá thành còn cao, khả năng tương hợp sinh học kém, gây ô nhiễm môi trường do quá bền vững, chậm phân hủy trong tự nhiên. 1.4.3. Một số phương pháp chủ yếu tạo E cđ [19][22][25] E cố định được nghiên cứu và ứng dụng từ những năm 1950. Để chế tạo E cố định có thể dùng các phương pháp hấp phụ, liên kết hóa trị để gắn E. Chất dùng để gắn kết E gọi là chất mang, hiện nay người ta thường dùng 2 nhóm chất mang là vô cơ như Carbon hoạt tính, celite, … và hữu cơ như cellulose, tinh bột, sephadex,

15 agarose,…Chế phẩm E không tan có thể ở dạng bột, hạt, phiến, màng mỏng. Trong một số trường hợp không cần thiết phải gắn E vào chất mang mà có thể giữ nó ở bên trong mạng lưới polyme. Mạng lưới này không cho phép E thoát ra khỏi mạng nhưng vẫn đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra qua lại dễ dàng. 1.4.3.1. Phương pháp vật lí [19][4] Qui trình thực hiện phương pháp khá đơn giản: chất hấp phụ như cellulose, dextran, thủy tinh xốp, silicagel, … được trộn lẫn với E, ủ trong một khoảng thời gian cho phép rồi lọc, rửa phần E không hấp thụ. Sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác của các liên kết ion kị nước, hydrogen và lực Vande Waals … Đối với một số chất mang vô cơ như thủy tinh xốp, silicagel và silochrom cần phải trải qua giai đoạn xử lí bề mặt trước khi sử dụng nhằm loại bỏ sự hấp phụ không đặc hiệu và đảm bảo độ bền và độ chọn lọc cao của đoạn gắn E. Ưu điểm của phương pháp này là hoạt tính E cố định thường cao. Tu y nhiên, nhược điểm là hoạt tính không ổn định lâu dài, E có thể bị giải hấp phụ do sự thay đổi pH, nhiệt độ và thành phần ion. 1.4.3.2. Phương pháp hóa học [19][24] Cố định E bằng liên kết cộng hóa trị với các polymer đã được hoạt hóa là một trong những phương pháp cố định E phổ biến nhất, đảm bảo liên kết vững chắc của E với chất mang. Điều kiện cơ bản để gắn E vào chất mang không hòa tan hoặc gắn các phân tử E riêng biệt vào nhau bằng liên kết cộng hóa trị là làm thế nào để các nhóm có thể hiện hoạt tính của E không bị tham gia vào phản ứng. Các polymer thường dùng trong phương pháp này là cellulose, alginic acid, chitin, collagen và keratin; những chất mang polymer tổng hợp có polymer của acylic acid, polyurethane, các dẫn xuất N-vinylpyrrolidon,... 1.4.3.3. Phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel [19] Để bao được E trong khuôn gel, tiến hành trùng hợp hóa các gel khi có mặt enzyme. E thường được nhốt trong gel của polyacrylamide, calcium alginate,

16 polyvinylpirolindon, polyhydroxymethacylate, và một số gel khác. Kết quả thu được là các E bị nhốt vào trong các lỗ gel. Lỗ gel nhỏ thì E sẽ được giữ chặt ở trong lỗ gel. Có thể nghiền nhỏ gel đã có E bằng cách đồng hóa hoặc ép qua rây rồi đem sấy khô ở nhiệt độ thấp. Hiệu quả của việc nhốt và hoạt độ riêng của E cđ phụ thuộc vào thành phần và hoạt tính của gel. Nhược điểm của phương pháp này là E cđ có thể bị giảm hoạt tính do sự phân bố không đều của E trong gel. Thực nghiệm cho thấy chỉ những E nằm gần bề mặt gel là tiếp xúc được với cơ chất và tham gia xúc tác phản ứng. 1.4.3.4. Phương pháp microcapsule (phương pháp tạo vi túi) [19] Đây là một hướng cố định E bằng phương pháp vật lí được sử dụng rộng rãi hiện nay. Là quá trình tạo vi túi có màng không thẩm thấu đối với E và chất có trọng lượng phân tử cao nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm dễ dàng thẩm thấu qua. Phương pháp này cho phép giữ E trong dung dịch gần giống với tự nhiên và sử dụng E nhiều lần vì có thể tách và thu nhỏ nó dễ dàng khỏi sản phẩm của quá trình phản ứng bằng cách lọc. Phương pháp tạo microcapsule rất tiện lợi để cố định các hệ polyenzyme (đa enzyme). Bên cạnh việc tạo microcapsule bằng màng bán thấm còn có thể tạo microcapsule bằng màng lỏng. Màng lỏng là một pha không tan trong nước cấu tạo từ các chất có hoạt tính bề mặt, dung môi hữu cơ và các chất ổn định, pha này chứa các giọt nhũ có kích thước từ vài μm đến vài mm có chứa dung dịch hay huyền phù của E. 1.4.3.5. Phương pháp siêu lọc [19] Enzyme được giữ lại trong các màng, các sợi siêu lọc. Những sợi này được chế tạo từ những polymer tự nhiên hoặc tổng hợp. Sự cố định có hiệu quả E trong vật liệu xốp có kích thước lỗ ở thành sợi từ 5-10µm có thể thực hiện bằng cách làm đầy thể tích sợi bằng dung dịch E và ủ trực tiếp E trong đó. Khi hệ trên hoạt động thì cơ chất sẽ đi qua những lỗ của sợi (phương pháp tái hồi lưu) hoặc dưới áp suất đi qua lỗ vào của lớp vỏ, trong khi lỗ ra đóng (phương pháp rửa ngược).

17 Phương pháp này đã được sử dụng để cố định các glucoamylase, glucoisomerase, galactosidase. 1.4.4. Lựa chọn phương pháp cố định Xác định phương pháp cố định E đóng vai trò quan trọng trong thao tác cố định E. Sự lựa chọn ban đầu thường được thực hiện bằng thực nghiệm. Để quá trình cố định có kết quả cần phải để ý đến các yếu tố sau: - E phải cố định trong những điều kiện diễn ra phản ứng. - Các chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang chủ yếu chỉ tương tác với các nhóm chức năng nằm ngoài tâm hoạt động của E. Nếu điều kiện trên không thực hiện được thì chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang phải có kích thước lớn không cho phép nó xâm nhập vào tâm hoạt động của E. - Tâm hoạt động phải luôn được bảo vệ, đôi khi có thể che tầm hoạt động bằng cách bổ sung vào hỗn hợp phản ứng cơ chất đã được bão hòa bởi E. - Biện pháp rửa tách E không được gắn phải cẩn thận, không gây ảnh hưởng xấu đến E đã được gắn. - Khi lựa chọn hệ số cố định, cần phải để ý đến phản ứng cụ thể. Cần tính đến cách tính cơ học của chất mang. Điều này quan trọng hơn với những chất mang được sử dụng trong những cột lớn. 1.4.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định E [19] 1.4.5.1. Ảnh hưởng của chất mang [19] Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ hóa, điện tích, tính háo nước và kị nước, … đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng E được liên kết, đến tính bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất E không tan. Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất E và ảnh hưởng tới khả năng chất mang hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng.

18 Sự định vị E giúp cho dẫn xuất E không tan có tính bền nhiệt cao hơn E tan. Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của E trong các dung môi, làm đứt mối liên kết hydro và liên kết kị nước. 1.4.5.2. Ảnh hưởng của pH [19] Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối ưu của E không tan. pH tối ưu của E không tan có thể bị chuyển dịch về phía kiềm hay acid so với pH tối ưu của enzyme hòa tan. 1.4.6. Ứng dụng E cđ và các thành tựu nghiên cứu về E cđ [23][27][28][29] Enzyme cố định lần đầu tiên được ứng dụng ở qui mô công nghiệp vào năm 1969 do Chibata và các cộng sự. Aminoacylase được cố định trên DEAE – sephadex nhờ liên kết ion để chuyển hóa hỗn hợp D, L – acid amin thành L – acid amin. Mosbach (1970) đã cố định tổ hợp cả ba loại enzyme là β – galactosidase, hexokinnase và gluco-6-phosphat dehydrogenase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex. Tế bào vi sinh vật cố định lần đầu tiên được ứng dụng ở qui mô công nghiệp cũng được thực hiện bởi Chibat (1973), Chibata và công sự đã cố định E.coli trong gel polyacrylamide để sản xuất acid L-aspartic từ amonium fumarat nhờ hoạt tính aspartase rất cao của E.coli. Từ những thành công bước đầu này đã mở ra những ứng dụng to lớn của E cđ và tế bào cố định với y học và công nghiệp. 1.4.6.1 Ứng dụng trong y học [19] Enzyme cố định đã có những thành tựu to lớn trong y học, đặc biệt để chữa các bệnh di truyền do thiếu E hoặc hoạt độ của E tương ứng không đủ mạnh chẳng hạn như bệnh plenylxeton niệu hoặc bệnh suy thận mãn tính. Nếu đưa trực tiếp E không thuần khiết vào để chữa bệnh có thể dẫn đến dị ứng hoặc phản ứng miễn dịch. Chang vào năm 1954 đã tạo ra vi tiểu cầu bán thấm có gắn urease, nhờ đó E có thể tồn tại lâu trong cơ thể do cơ chất và sản phẩm phản ứng dễ dàng đi qua màng, còn E thì biệt lập

19 với môi trường xung quanh. Nhờ đó tạo được trong cơ thể một nồng độ có hiệu quả cao của E thiếu mà vẫn không gây phản ứng phụ. Một ứng dụng khác của urease gắn trong vi tiểu cầu được sử dụng có hiệu quả để loại ure của máu trong chạy thận nhân tạo. Vi tiểu cầu chứa catalase có thể thay thế một cách hiệu quả các catalase thiếu trong cơ. Sử dụng E cđ còn đem lại nhiều triển vọng trong chữa bệnh hiểm nghèo như ung thư. Đưa vi tiểu cầu có gắn L-asparaginase vào cơ thể có khả năng ức chế sự phát triển của một số khối u ác tính bởi sự phát triển của các khối u này phụ thuộc vào sự có mặt của L-asparagin. Ngoài ra, E cđ còn là công cụ đắc lực trong chẩn đoán bệnh như enzyme horse radish peroxidase được cố định trên polystyren cùng với kháng thể hay kháng nguyên gây bệnh giúp chẩn đoán nhanh và chính xác – kỹ thuật ELISA. Các chế phẩm này được thương mại hóa như các test ELISA chẩn đoán siêu vi B. 1.4.6.2. Ứng dụng trong kỹ thuật sinh hóa [19][36] E cđ là công cụ phân tích sinh hóa có giá trị. Năm 1970, Bernty đã dùng glucooxidase gắn bằng đồng hóa trị ở trong cột polystirol để xác định tự động glucose. Khi đặt điện cực E tiếp xúc với dung dịch nghiên cứu có chứa cơ chất của E, trong lớp điện cực sẽ xảy ra phản ứng E. Với ứng dụng này, người ta đã xác định liên tục nồng độ glucose nhờ glucooxidase không tan. Và cũng trên nguyên tắc đó, nhà khoa học Clark đã đề ra phương pháp xác định metanol và etanol trong nước và trong hơi nước nhờ điện cực có chứa alcoloxydoreductase cố định. 1.4.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp [19] Enzyme cố định có ứng dụng trong công nghiệp khá đa dạng, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà sản xuất. Các ngành công nghiệp: bia, rượu, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất hóa chất, …đều có nhiều ứng dụng E cđ trong qui trình sản xuất. Các lĩnh vực đã sử dụng ở qui mô công nghiệp: - Sản xuất hỗn hợp glucose – fructose từ tinh bột thông qua glucoisomerase.

20 - Tách hỗn hợp L – aminoacid và D – aminoacid nhờ L – aminoacylase để sản xuất L – aminoacid. - Thu nhận D – aminoacid nhờ aspartare. - Sinh tổng hợp L – succinic acid nhờ fumarase. - Thu nhận 6 – APA (6 – aminopenicillinamidase) nhờ penicillinamidase. - Thu nhận sữa không có lactose (sữa phi – lacto) nhờ lactase. 1.4.6.4. Ứng dụng trong bảo vệ môi trường [19] Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường, … chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu hữu cơ. Do đó có thể sử dụng E cđ để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra môi trường bên ngoài. Ở Việt Nam, những nghiên cứu cố định E chỉ mới bắt đầu trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn rất hạn chế. Năm 1994-1995 Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu cố định glucoisomerase trên các hạt Silochrom B 2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde. Hiện nay Viện cũng đang nghiên cứu sử dụng chế phẩm glucoisomerase cố định của Novo (Đan Mạch) để sản xuất siro fructose, tuy nhiên mới chỉ ở qui mô phòng thí nghiệm. Những năm gần đây, Phòng Công nghệ bức xạ, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định enzyme, tế bào và các chất có hoạt tình sinh học khác bằng kỹ thuật bức xạ như cố định glucoamylase, protease, vi khuẩn tả (Vibro cholerae), tế bào nấm men (Saccharomyces serevisa e), vi khuẩn xử lí nước thải trên polymer tổng hợp được chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ. 1.5. Sự thủy phân tinh bột và ứng dụng sản phẩm sau thủy phân 1.5.1. Đại cương về tinh bột [31]

21 Tinh bột là polysaccarit chủ yếu có trong hạt, củ, thân cây và lá cây, phân tử lượng cao gồm các đơn vị α-glucose được nối nhau bởi các liên kết α- glycoside, có công thức phân tử là (C 6 H 10 O 5 )n. Tinh bột không phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và amilopectin. Tỉ lệ amylose/amylopectin xấp xỉ ¼. Tuy nhiên, tỉ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ, tùy loại tinh bột và kĩ thuật canh tác. Amylose: cấu tạo mạch thẳng gồm những đơn vị α – glucose (200 – 1000 gốc) liên kết nhau bằng liên kết 1,4-O-glycoside. Hàm lượng amylose có ý nghĩa rất lớn đến tính chất tinh bột, có liên quan mật thiết với các tính chất chức năng như độ nhớt, độ dẻo, dai, phồng nở...và vì vậy ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng của tinh bột. Tinh bột có hàm lượng amylose cao có cấu trúc hồ bột cứng dễ bẻ gãy trong khi tinh bột có hàm lượng amilose thấp (100% là amylopectin) cho loại hồ bột mềm hơn và dai hơn. Amylopectin: cấu tạo có mạch nhánh và mạch thẳng kết hợp nhau do các α – glucose liên kết nhau bằng liên kết 1,4-O-glycoside tạo các đoạn mạch thẳng, còn liên kết 1,6-O-glycoside tạo các đoạn mạch nhánh. Tỷ lệ các liên kết α-D-(1-6) so với các liên kết α-D-(1-4) trong amylopectin ước tính khoảng từ 5 đến 6%. Khi bị đun nóng trong nước, các hạt tinh bột thủy phân, cấu trúc bị phá vỡ và giải phóng amylose và amylopectin. Các phân tử hầu hết đều tan trong nước và cho độ nhớt cao, tạo ra một dung dịch đồng nhất hay còn gọi là hồ tinh bột tùy theo mật độ tinh bột. Hình 1.3: Cấu tạo tinh bột

22 1.5.2. Đặc tính tinh bột sắn và tinh bột bắp [1][10] 1.5.2.1. Đặc tính tinh bột sắn [1][10] Hạt tinh bột sắn (củ khoai mì) có kích thước trung bình 5-35 nm, hình tròn. Thành phần hoá học chính của củ sắn tươi (%): Nước: 70,25; Tinh bột: 20-34; Protein: 0,8-1,2; Chất béo: 0,3-0,40; Cellulose: 1,1-3,1; Đường: 5,13; Hàm lượng amilose: 25;…Trong củ sắn một hợp chất phaseolunatin chiếm tỉ lệ 0,001-0,04mg% gây ngộ độc khi bị thủy phân giải phóng ra HCN. Tỷ lệ amylose và amylopectin thông thường trong tinh bột sắn tương ứng là 20% và 80% (tỷ lệ này có thể thay đổi tùy theo điều kiện canh tác và sinh trưởng). Trong quá trình tổng hợp sinh học tinh bột, cấu trúc bán tinh thể của amylose và amylopectin được xếp chặt vào bên trong các hạt tinh bột có kích thước từ 10 đến 35µm đối với củ sắn (Tongdang, 2001). Tinh bột sắn có độ trong cao hơn các tinh bột ngũ cốc do sự liên kết yếu giữa các phần tử tinh bột trong hạt. Độ nhớt của tinh bột sắn cũng đạt giá trị khá cao. Nhiệt độ hồ hóa trung bình 67-75 o C. Hồ bột sắn thường dai là do hàm lượng amylose tương đối thấp (20-25%) và do cấu trúc của amylopectin. 1.5.2.2. Đặc tính tinh bột bắp [14][31] Bắp là cây trồng chiếm 36% sản lượng trên thế giới. Bên cạnh vai trò lương thực, nguồn tài nguyên tự nhiên, tái sinh được, đa dụng và có tính tự hoại này đang có nhiều ứng dụng khác trong thương mại. Tinh bột, thành phần chính có trong bắp, là một polysaccharide hình thành từ nhiều nhóm đường đơn α-glucose với liên kết carbon 1-4 tạo thành mạch dài chứa 500-2000 đơn vị đường đơn glucose. Hạt tinh bột bắp (bắp vàng) có kích thước trung bình 5-20μm, hình đa giác, tròn. Có thành phần (%) hóa học chính như sau: amylose: 20; protein: 6-10; độ ẩm trung bình khoảng 9,5; chất tro: 1,6; chất béo: 5,1; cellulose: 4.1; …Nhiệt độ hồ hóa khoảng 52-59 o C.