Luận án Tiến sĩ Y học: Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập tại Bệnh viện Nhi Trung ương, 2009 - 2010
398
399
126
51
- Máy chuyển ADN lên màng lai (Prehybridization)
- Máy Hybridization
2.4.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.4.3.1. Lấy bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập
Mẫu bệnh phẩm để xác định căn nguyên gây NKHHCT trẻ em được lấy từ
dịch tỵ hầu, dịch hút nội khí quản hoặc dịch rửa phế quản. Cách lấy bệnh phẩm
được thực hiện theo thường quy của Tổ chức Y tế thế giới (WHO).
* Cách lấy bệnh phẩm tỵ hầu:
Bệnh nhân được bế ngồi trong lòng người lớn ở tư thế khám họng
( mặt nhìn ra phía trước, đầu hơi ngả ra phía sau).
Dùng loại tăm bông có cán được làm bằng kim loại mềm, không gỉ vào
qua lỗ mũi một đoạn bằng chiều dài 1/2 từ cánh mũi đến dái tai cùng bên.
Xoay tròn tăm bông vài lần rồi nhẹ nhàng kéo ra đưa vào tuýp có môi
trường vận chuyển .
Cắt đoạn trên của tăm bông, phần không chạm vào tuýp và đậy chặt nắp.
Dán nhãn trên tuýp đựng mẫu bệnh phẩm.
Hoàn thành các mẫu theo yêu cầu của phòng thí nghiệm.
* Cách lấy bệnh phẩm đường hô hấp dưới:
Bệnh nhân được lấy dịch nội khí quản qua sonde vô trùng sau khi được
đặt nội khí quản hoặc dịch rửa phế quản qua nội soi phế quản.
Dán nhãn trên ống đựng mẫu bệnh phẩm.
Hoàn thành các mẫu theo yêu cầu của phòng thí nghiệm.
* Vận chuyển mẫu bệnh phẩm:
Chuyển đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt để giảm tối đa sự
phát triển của vi khuẩn hội sinh .
2.4.3.2. Nuôi cấy, phân lập, xác định căn nguyên vi khuẩn:
Thực hiện theo thường quy của WHO và Viện Y học Nhiệt đới thuộc đại học
Nagasaki- Nhật Bản [7], [17], [59], [79], [93], [116].
*Xử lý bệnh phẩm:
52
Bệnh phẩm được đưa vào ống nghiệm vô trùng chứa 1ml canh thang BHI.
Dùng máy lắc trộn đều, rồi loại bỏ tăm bông. Lúc này, dung dịch bệnh phẩm đã
được pha loãng 100 lần (vì bệnh phẩm lấy được bằng tăm bông tương đương 0,01
ml pha trong 1ml canh thang BHI).
* Sơ đồ2.1. Sơ đồ nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn.
*Kỹ thuật cấy đếm: dùng máy lắc trộn đều ống số 1, sau đó lấy 0,5 ml hỗn
dịch trộn với 4,5 ml NaCl 0,9% ở ống số 2. Tiếp tục làm như vậy cho đến ống số
6.
Tại ống số 6, sau khi đã trộn đều hỗn dịch thì bỏ đi 0,5 ml. Như vậy, bệnh phẩm
đã
được pha loãng thành 6 độ: 10
-2
; 10
-3
; 10
-4
; 10
-5
; 10
-6
; 10
-7
.
Từ các nồng độ pha loãng trên, dùng que cấy chuẩn lấy 1 ăng đầy
(tương đương 0,01 ml hỗn dịch) cấy lên 1/6 đĩa thạch TM,CHO được đánh số tương
ứng, với lưu ý cấy từ nồng độ loãng nhất đến nồng độ đặc nhất. Chờ se mặt thạch,
lật
ngược đĩa thạch, để vào tủ ấm 35 - 37
0
C trong khí thường có 5% CO
2
, sau 24 giờ đọc
kết quả.
53
Nếu sau 24 giờ, chưa thấy vi khuẩn mọc thì tiếp tục để trong điều kiện
như trên, thêm 24 giờ nữa. Sau 48 giờ nuôi cấy, không thấy vi khuẩn mọc thì bệnh
phẩm đó được kết luận là âm tính.
Nếu có vi khuẩn mọc thì tiến hành đếm và tính số lượng khuẩn lạc như sau:
o Số lượng khuẩn lạc = n x 10
2
x nồng độ pha loãng.
o Ví dụ: ở vùng 5 số khuẩn lạc đếm được là 7, thì số lượng khuẩn lạc ở
vùng 5 = 7 x10
2
x 10
6
.
Ở đây x10
2
vì: 1 ăng chuẩn tương đương 0,01 ml. Số lượng khuẩn lạc lại
được tính cho 1ml bệnh phẩm.
Nếu ở một nồng độ lại có 2 hoặc 3 loại khuẩn lạc mọc thì cách tính số
lưọng khuẩn lạc như trên (số lượng khuẩn lạc được tính cho 2 hoặc 3 loại vi
khuẩn/1ml).
Theo Oishi Nagatake và cộng sự để khẳng định căn nguyên gây
NTHHCT ở trẻ nhỏ có biểu hiện lâm sàng, kết quả nuôi cấy vi khuẩn phải lớn hơn
hoặc bằng 10
6
CFU/1ml.
* Đối với bệnh phẩm có lớn hơn hoặc bằng 10
6
CFU/1ml, tiến hành nhuộm Gram
và thử oxydase (âm tính) => đưa và máy định danh để có chẩn đoán xác định là
Klebsiella pneumoniae.
* Định danh vi khuẩn bằng máy VITEK 2:
Trên thạch dinh dưỡng hay thạch máu, khuẩn lạc vi khuẩn cần định danh đã
được nuôi cấy thuần nhất sau 18 - 24 giờ. Tiến hành nhuộm gram, soi và xác định
hình thể vi khuẩn:
- Nếu là cầu trùng gram dương tiến hành thử nghiệm catalase
+ Catalase dương tính => sử dụng card định danh tụ cầu
+ Catalase âm tính =>làm thử nghiệm optochin
* Optochin dương tính => sử dụng card định danh phế cầu
* Optochin âm tính => sử dụng card định danh liên cầu
- Nếu là nấm => sử dụng card định danh nấm
54
- Nếu là khuẩn lạc hơi xám, chỉ mọc trên chocolate còn trên thạch máu
không mọc hoặc mọc yếu, nhuộm Gram soi thấy hình ảnh trực khuẩn gram âm đa
hình thái nghĩ tới Heamophilus sử dụng card NH định danh cho Heamophilus.
- Nếu là trực khuẩn gram âm sử dụng card định danh GN test kit code 21341,
dựa trên 54 tính chất sinh vật hóa học cho xác định các trực khuẩn gram âm. 54
tính
chất sinh vật hóa học sau để khẳng định là chủng vi khuẩn Klebsiella spp.
APPA - dGLU + BAap - dTAG - NAGA - CMT -
ADO + GGT + ProA - dTRE + AGAL + BGUR -
PyrA + OFF + LIP - CIT + PHOS + O129R
+
dCEL + BGLU + PLE + MNT + GlyA - GGAA +
BGAL + dMAL + TyrA - 5KG - ODC - IMLTa -
H2S - dMAN + URE - ILATk + LDC + ELLM -
BNAG - dMNE + dSOR + AGLU - IHISA - ILATa -
AGLTp
- BXYL + SAC + SUCT + BXYL IARL -
2.4.3.3. Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán trên thạch
+ Nguyên lý:
Các loại kháng sinh khác nhau đã được tẩm trong các khoanh giấy, sẽ khuếch
tán trong thạch và kìm hãm sự phát triển của chủng vi khuẩn trên bề mặt thạch,
tạo thành các vòng ức chế. Dựa vào đường kính vòng ức chế để đánh giá mức
độ nhạy cảm của chủng vi khuẩn với kháng sinh tương ứng.
+ Mục đích :
Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh với các
loại kháng sinh khác nhau.
* Kỹ thuật [26], [25], [43], [71], [84], [90].
- Chuẩn bị môi trường:
Môi trường MH (có thể cho thêm chất bổ sung tùy loại vi khuẩn) được
chuẩn bị trong hộp lồng với độ dày 4-5mm, lưu ý khi đổ môi trường cần đặt trên
một mặt phẳng, để đảm bảo độ dầy của thạch đồng đều. Môi trường đã được chuẩn
55
bị có thể bảo quản trong túi nylon kín, giữ ở 4-8
0
C, sử dụng trong 2 tuần. Trước khi
sử dụng, nên phơi trong tủ ấm 37
0
C/15phút.
- Chuẩn bị chủng:
Vi khuẩn đã được định danh, thuần khiết, nuôi cấy 18-24h trên môi trường
không có chất ức chế (tùy loại vi khuẩn sẽ cần môi trường thích hợp để phát
triển tốt,
xem phần 2.3.), lấy vi khuẩn hòa trong canh thang MH, nước muối sinh lý 0,9%
NaCl
hoặc dùng đệm PBS pH 7,2 tùy loại vi khuẩn so với độ đục chuẩn McFarland 0,5 để
có huyền dịch vi khuẩn ban đầu tương ứng với 10
8
vi khuẩn/1ml. Sau đó tiếp tục pha
loãng huyền dịch này 1/100 (hoặc 1/10 tùy theo mỗi loại vi khuẩn) trong canh
thang
MH hoặc nước muối sinh lý để có huyền dịch vi khuẩn 10
6
vi khuẩn/1ml (hoặc 10
7
,
hoặc 10
8
vi khuẩn/1ml, tùy theo mỗi loại vi khuẩn). Có thể tạo huyền dịch vi khuẩn
bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang MH ở 37
0
C/3-5h có lắc (nồng độ vi
khuẩn này tương đương với độ đục chuẩn Mc-Farland 0,5 là 10
8
vi khuẩn/1ml).
* Tiêu chuẩn để đánh giá một huyền dịch vi khuẩn pha đạt chuẩn được dựa
trên hình ảnh kháng sinh đồ, các khuẩn lạc đứng cạnh nhau, không chồng dày lên
nhau.
- Cấy vi khuẩn:
Láng huyền dịch vi khuẩn 10
6
vi khuẩn/1ml (hoặc 10
7
, hoặc 10
8
vi
khuẩn/1ml, tùy theo loại vi khuẩn) lên bề mặt thạch, dùng pipette Pasteur loại
bỏ
huyền dịch vi khuẩn còn thừa ra khỏi đĩa thạch. Hoặc dùng tăm bông dàn đều vi
khuẩn lên bề mặt thạch, sau đó để hộp thạch khô tự nhiên hoặc phơi trong tủ ấm
35-
37
0
C/15-30 phút.
- Đặt khoanh giấy kháng sinh:
Dùng dụng cụ đặt khoanh giấy hoặc dùng pince kẹp để đặt khoanh giấy
kháng sinh, sao cho khoảng cách giữa các khoanh giấy cách nhau 2cm và cách mép
hộp lồng 2cm, hộp lồng tròn đường kính 90mm đặt tối đa 7 khoanh giấy (6 khoanh
xung quanh và 1 khoanh ở giữa), hộp lồng vuông cạnh 120mm đặt tối đa 16 khoanh
giấy (bốn hàng x 4 khoanh/hàng). Sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, cần để hộp
lồng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi cất trong tủ ấm 35-37
0
C (Để lật ngược nắp
56
hộp lồng xuống dưới, tránh hiện tượng hơi nước tích tụ rơi từ nắp hộp xuống mặt
thạch đã láng vi khuẩn, làm ảnh hưởng đến kết quả).
- Đọc kết quả :
- Đọc kết quả sau khi đã để tủ ấm 35-37
0
C/18-24h.
- Dựa vào bảng chuẩn để xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của từng
loại vi khuẩn khác nhau.
- Có ba mức độ nhạy cảm được qui định: nhạy cảm(Susceptible -viết tắtS)
,trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R).
- Các chủng chuẩn được tiến hành song song với các mẫu bệnh phẩm để
kiểm tra chất lượng kỹ thuật
Hình 2.1. Kháng sinh đồ trên hộp lồng vuông cạnh 120mm
2.5.3.4. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch để xác định khả năng sinh
men β-lactamase phổ rộng (ESBL) của vi khuẩn (CLSI)
Mục đích: Xác định xem các chủng Klebsiella spp. phân lập tại Bệnh viện
Nhi trung ương có sinh men β-lactamase phổ rộng không.
Nguyên lý: Nếu các chủng vi khuẩn được thử có sinh ra men β-lactamase
phổ rộng, nó sẽ phân huỷ kháng sinh cefotaxim và ceftazidim, làm cho vòng vô
khuẩn của các kháng sinh này giảm xuống tới mức nhạy cảm vừa (Intermidiated – I)
hoặc kháng (Resistance – R). Kháng sinh augmentin (phối hợp của hai kháng sinh:
amoxicillin và acid clavulanic), có chất ức chế men β-lactamase phổ rộng là axid
clavulanic, nên kháng sinh amoxicillin không bị phá huỷ và có vòng vô khuẩn ở
mức nhạy cảm (Sensitive – S). Đồng thời ở vùng giáp ranh giữa các kháng sinh
57
augmentin (AMC) với cefotaxim (CTX), augmentin (AMC) với ceftazidim (CAZ),
do men - lactamase phổ rộng của vi khuẩn ở 2 vùng này bị ức chế bởi chất ức
chế
axid clavulanic từ khoanh giấy kháng sinh augmentin nên cefotaxim và ceftazidim
không bị phá huỷ, vi khuẩn bị tiêu diệt, làm xuất hiện sự mở rộng vòng vô khuẩn
ở
đây. Được gọi là hình ảnh hiệp đồng (hình ảnh nút chai sâm panh)
Kháng sinh:
4 khoanh giấy kháng sinh được lựa chọn để phát hiện sự sinh men -
lactamaza phổ rộng của vi khuẩn được thử là:
- Aztreonam (ATM - thuộc họ monobactam).
- Cefotaxim (CTX) và Ceftazidim (CAZ) là hai cephalosporin thế hệ III, bị
phá huỷ bởi men β-lactamase phổ rộng.
- Augmentin (AMC) là một kháng sinh phối hợp giữa amoxicillin với một
chất ức chế - lactamase là axid clavulanic.
Các bước tiến hành:
Tiến hành các bước tương tự ở phương pháp khoanh giấy khuếch tán. Đầu
tiên, pha canh khuẩn có nồng độ 10
8
vi khuẩn/ml, sau đó pha loãng thành nồng độ
10
6
vi khuẩn/ml. Láng canh khuẩn này lên bề mặt thạch, hút canh khuẩn thừa bỏ đi,
để khô mặt thạch. Dùng kim tiêm sạch đặt 4 khoanh giấy lên bề mặt thạch theo sơ
đồ hình 4
Sơ đồ 2.2. Đặt khoanh giấy kháng sinh xác định men - lactamase phổ rộng.
AMC
ATM
CTX
CAZ
58
Ghi chú: AMC - augmentin,ATM - Aztreonam,
CTX - cefotaxim, CAZ – ceftazidim.
Sau khi để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán đều, cho
vào tủ ấm 35-37
0
C/18 giờ với tư thế đảo ngược đĩa thạch.
Đánh giá kết quả
- lactamase phổ rộng dương tính (có sinh men β-lactamase phổ
rộng) trong trường hợp chủng vi khuẩn nhạy cảm với AMC nhưng kháng CTX,
CAZ, ATM và có hình ảnh hiệp đồng ở vùng giáp ranh giữa các khoanh giấy
AMC với CTX, AMC với ATM hoặc AMC với CAZ.
Nghĩa là:
- Vi khuẩn sinh men β-lactamase phổ rộng bị ức chế bởi chất ức chế là axid
clavulanic, nên nhạy cảm với AMC.
- Men β-lactamase này có phổ mở rộng nên đã tác động đến các
cephalosporin thế hệ III, vì thế CTX, CAZ và ATM đều bị kháng hoặc giảm tính
nhạy cảm ( R hoặc I).
- Nhưng riêng vùng giáp ranh giữa các khoanh giấy AMC với CTX hoặc
AMC với CAZ hoặc AMC với ATM do có sự ức chế bởi chất ức chế là axid
clavulanic nên men β-lactamase phổ rộng không tác động vào các cephalosporin
thế hệ III, vi khuẩn bị diệt tạo hình ảnh mở rộng của vòng vô khuẩn. Được gọi là
hình ảnh hiệp đồng (hình ảnh nút chai sâm panh)
Còn lại các trường hợp khác đều đọc là men β-lactamase phổ rộng âm
tính (không sinh men β-lactamase phổ rộng ).
2.4.3.5. Xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum
Inhibitory Concentration - MIC)
- Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ
nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn
trong
môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).
59
- Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi
đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn và
bằng
mắt thường đã có thể xác định được điều này.
- Kỹ thuật [43], [77],[84], [87].
+ Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch “mẹ”)
+Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm: Dựa
trên hoạt lực của kháng sinh (được ghi trên các nhãn lọ), cần tính để pha dung
dịch
“mẹ” theo công thức sau:
Ví dụ: Kháng sinh chloramphenicol có hoạt lực 99,13%, nếu cần pha 10 ml
dung dịch kháng sinh “mẹ” có nồng độ 1600 g/ml, sẽ phải cân Xg kháng sinh:
Xg kháng sinh =
99,13
1600 x ml 10
= 16.140,421 g/ml = 0,016140 g/ ml
Kháng sinh bột sau khi được cân, sẽ pha với dung dịch đệm thích hợp, tùy
mỗi loại kháng sinh khác nhau sẽ có những dung môi và dung dịch đệm khác nhau
(phụ thuộc từng hãng sản xuất loại kháng sinh). Nhiều loại kháng sinh có thể hoà
tan và được pha loãng trong nước cất. Một số khác cần phải hoà tan trong các
dung
môi đặc biệt, sau đó mới được pha loãng trong nước cất. Dung dịch kháng sinh
“mẹ” sau khi pha xong, chia nhỏ ra các ống nghiệm, bảo quản trong lạnh âm 20
0
C
(trừ kháng sinh Acid nalidixic bảo quản ở nhiệt độ phòng). Khi đã lấy ra sử
dụng,
chỉ dùng trong 24h.
+ Pha các nồng độ kháng sinh
Dung dịch “mẹ”
Dung dịch
đệm PBS *
(hoặc nước cất)
Độ pha
Nồng độ
trung gian
(g/ml)
Nồng độ
cuối cùng
(g/ml)**
2,5 ml (1280
g/ml)
2 ml
1 ml
0,5 ml
0,5 ml
-
2ml
3 ml
3,5 ml
7,5 ml
-
1/2
1/4
1/8
1/16
1280
640
320
160
80
128
64
32
16
8
2ml (80
g/ml)
1 ml
0,5 ml
0,5
2 ml
3ml
3,5 ml
7,5 ml
1/2
1/4
1/8
1/16
40
20
10
5
4
2
1
0,5
60
2ml (5
g/ml)
1 ml
0,5 ml
0,5 ml
2 ml
3ml
3,5 ml
7,5 ml
1/2
1/4
1/8
1/16
2,5
1,25
0,64
0,32
0,25
0,125
0,064
0,032
2ml (0,32
g/ml)
1 ml
2 ml
3ml
1/2
1/4
0,16
0,08
0,016
0,008
Ghi chú:
* PBS: Dung dịch đệm phosphat dùng để pha loãng kháng sinh.
** Nồng độ cuối cùng pha loãng 1/10 trong môi trường, được tính theo tỷ lệ
trộn 2,5 ml dung dịch trung gian + 22,5 ml thạch MH.
- Các bước tiến hành
Ngày 1: Chuẩn bị chủng và môi trường
- Các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn quốc tế được cấy trong canh
thang thường hoặc canh thang MH để có được canh khuẩn non, theo tỷ lệ sau: trực
khuẩn Gram âm: cấy 0,1 ml;
- Chuẩn bị thạch MH: Cân thạch theo công thức (ghi trên hộp), đun sôi cho
tan hết thạch, hấp thạch ở 121
0
C/15’.
- Khi thạch đã nguội còn khoảng 40-50
0
C, dùng ống đong khắc vạch đong
22,5 ml thạch cho vào bình nón đã có sẵn 2,5 ml dung dịch kháng sinh theo các
nồng độ như trong bảng pha kháng sinh, lắc kỹ và đổ vào hộp lồng, khi thạch đã
đông cứng, bảo quản trong tủ lạnh 4 - 8
0
C (có thể bảo quản được trong 2 tuần). Mỗi
lần làm MIC cần 2 đĩa môi trường MH không có kháng sinh để làm đĩa chứng (cho
thêm 2,5 ml PBS hoặc nước cất + 22,5 ml môi trường thạch MH).
Ngày 2: Cấy vi khuẩn trên bề mặt đĩa thạch MH có nồng độ kháng sinh
khác nhau
- Cấy vi khuẩn thuần khiết từ canh khuẩn non (canh khuẩn đã cấy qua đêm
18h-tương đương 10
8
vi khuẩn/ml) hoặc lấy một số khuẩn lạc từ môi trường thạch
thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) để có độ
đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 10
8
vi khuẩn/ml. Tiếp tục
pha loãng 1/100 để có nồng độ 10
6
vi khuẩn/ml bằng cách dùng micropipet hút 20 l
cho vào 2 ml đệm PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%).