Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu các đột biến TP53, BRAF trong mô ung thư da và mối liên quan của nó với các thể bệnh

9,881
170
140
68
thêm nuleotid xảy ra chủ yếu vị trí g.11818-11819insC g.11874-
11875insC với tỷ lệ tương ứng là 30,2% 73,0%, đặc biệt biến đổi chèn
g.11874-11875insC xảy ra 100% các tế bào ung thư tế bào hắc tố. Biến đổi
thay thế nucleotid xảy ra ở các vị trí g.11827C>G, g11849G>A, g11903T>A,
các biến đổi này có tỷ lệ thấp chiếm 1,6%.
- Trong tất cả các mẫu nghiên cứu của chúng tôi không phát hiện thấy
biến đổi nào trên vùng IVS2.
* Đột biến ở đoạn Exon 3
Bảng 3.8. Đột biến ở đoạn exon 3
STT
Vị trí đột
biến
UT
TB đáy
(n=21)
UT
TB vảy
(n=21)
UT
TB hắc tố
(n=21)
Tổng (n=63)
n
%
1
g.12112G>T
3
0
0
3
4,8
2
g.12139C>A
10
3
0
13
20,6
3
g.12143T>A
1
0
0
1
1,6
4
g.12145G>T
1
0
0
1
1,6
5
g.12239G>A
1
0
0
1
1,6
Kết quả bảng trên cho thấy: trong các đột biến vùng exon 3 của
gen TP53, loại đột biến g.12139C>A (c.215C>A) cao nhất, có 10/21 mẫu
ung thư tế bào đáy bị đột biến dạng này, nếu tính chung trong 63 bệnh nhân
thì loại này chiếm tỷ lệ 20,6 %.
68 thêm nuleotid và xảy ra chủ yếu ở vị trí g.11818-11819insC và g.11874- 11875insC với tỷ lệ tương ứng là 30,2% và 73,0%, đặc biệt biến đổi chèn g.11874-11875insC xảy ra 100% ở các tế bào ung thư tế bào hắc tố. Biến đổi thay thế nucleotid xảy ra ở các vị trí g.11827C>G, g11849G>A, g11903T>A, các biến đổi này có tỷ lệ thấp chiếm 1,6%. - Trong tất cả các mẫu nghiên cứu của chúng tôi không phát hiện thấy biến đổi nào trên vùng IVS2. * Đột biến ở đoạn Exon 3 Bảng 3.8. Đột biến ở đoạn exon 3 STT Vị trí đột biến UT TB đáy (n=21) UT TB vảy (n=21) UT TB hắc tố (n=21) Tổng (n=63) n % 1 g.12112G>T 3 0 0 3 4,8 2 g.12139C>A 10 3 0 13 20,6 3 g.12143T>A 1 0 0 1 1,6 4 g.12145G>T 1 0 0 1 1,6 5 g.12239G>A 1 0 0 1 1,6 Kết quả ở bảng trên cho thấy: trong các đột biến ở vùng exon 3 của gen TP53, loại đột biến g.12139C>A (c.215C>A) là cao nhất, có 10/21 mẫu ung thư tế bào đáy bị đột biến dạng này, nếu tính chung trong 63 bệnh nhân thì loại này chiếm tỷ lệ 20,6 %.
69
* Đột biến ở đoạn Exon 4
Bảng 3.9. Đột biến ở đoạn exon 4
STT
Vị trí đột
biến
UT
TB đáy
(n=21)
UT
TB vảy
(n=21)
UT
TB hắc tố
(n=21)
Tổng (n=63)
n
%
1
g.13150C>T
1
0
0
1
1,6
2
g.13151C>T
1
0
0
1
1,6
exon 4 gặp 2 vị trí đột biến cả hai vị trí này đều xảy ra ở 1 mẫu bệnh nhân
ung thư da tế bào đáy, hai vị trí đột biến này nằm sát nhau trên vị trí của gen,
nhưng thuộc hai bộ ba mã hóa hai acid amin khác nhau.
* Biến đổi ở đoạn IVS5
- Trong nghiên cứu này chúng tôi không thấy biến đổi ở vùng IVS4
tất cả các mẫu ung thư da.
- vùng IVS5 chỉ gặp 1 biến đổi vị trí g.13451G>C của loại ung
thư tế bào đáy chiếm 4,8%, biến đổi này ở trạng thái dị hợp tử.
* Đột biến ở đoạn Exon 6
Bảng 3.10. Tỷ lệ đột biến ở đoạn Exon 6
STT
Vị trí đột
biến
UT
TB đáy
(n=21)
UT
TB vảy
(n=21)
UT
TB hắc tố
(n=21)
Tổng (n=63)
n
%
1
g.14049C>T
1
0
0
1
1,6
2
g.14060G>T
7
0
0
7
11,1
3
g.14062C>A
7
0
0
7
11,1
69 * Đột biến ở đoạn Exon 4 Bảng 3.9. Đột biến ở đoạn exon 4 STT Vị trí đột biến UT TB đáy (n=21) UT TB vảy (n=21) UT TB hắc tố (n=21) Tổng (n=63) n % 1 g.13150C>T 1 0 0 1 1,6 2 g.13151C>T 1 0 0 1 1,6 Ở exon 4 gặp 2 vị trí đột biến cả hai vị trí này đều xảy ra ở 1 mẫu bệnh nhân ung thư da tế bào đáy, hai vị trí đột biến này nằm sát nhau trên vị trí của gen, nhưng thuộc hai bộ ba mã hóa hai acid amin khác nhau. * Biến đổi ở đoạn IVS5 - Trong nghiên cứu này chúng tôi không thấy biến đổi ở vùng IVS4 ở tất cả các mẫu ung thư da. - Ở vùng IVS5 chỉ gặp 1 biến đổi ở vị trí g.13451G>C của loại ung thư tế bào đáy chiếm 4,8%, biến đổi này ở trạng thái dị hợp tử. * Đột biến ở đoạn Exon 6 Bảng 3.10. Tỷ lệ đột biến ở đoạn Exon 6 STT Vị trí đột biến UT TB đáy (n=21) UT TB vảy (n=21) UT TB hắc tố (n=21) Tổng (n=63) n % 1 g.14049C>T 1 0 0 1 1,6 2 g.14060G>T 7 0 0 7 11,1 3 g.14062C>A 7 0 0 7 11,1
70
Kết quả bảng trên cho thấy: đột biến exon 6 chỉ xuất hiện các
mẫu ung thư tế bào đáy. Không thấy đột biến exon 6 xảy ra với các mẫu ung
thư tế bào vảy và ung thư tế bào hắc tố. Các đột biến exon 6 của các mẫu ung
thư tế bào đáy đều đột biến đồng hợp tử, các đột biến này gây thay đổi
trình tự mã hóa các acid amin. 7 mẫu bị đột biến đồng thời ở cả hai vị trí
g.14060G>T và g.14062C>A, hai vị trí này trên exon 6 liên quan đến 1 bộ ba
mã hóa (GGC, mã hóa acid amin là Glycine), khi đồng thời hai đột biến xảy
ra, bộ ba mã này bị đổi thành TGA, chuyển thành mã kết thúc (hình 3.10).
* Biến đổi ở đoạn IVS6
Kết quả biến đổi xảy ra ở IVS6 gặp với tần suất cao, trong đó ung thư
tế bào đáy cũng chiếm chủ yếu các biến đổi ở IVS6, tiếp đó là ung thư tế bào
vảy và cuối cùng ung thư tế bào hắc tố. Mặc dù các biến đổi IVS ở ung thư
tế bào hắc tố ít, nhưng là toàn bộ các mẫu xảy ra cùng một biến đổi. Các biến
đổi dạng thay thế nucleotid tại vùng intron vùng không hóa nên về
mặt thuyết sẽ không ảnh hưởng tới sự phiên hậu phiên mã. Tuy
nhiên trong số 35 biến đổi IVS6, có 3 biến đổi chèn thêm nucleotid trên đoạn
gen g.14245-14246insG, g.14247-14248insG g.14251-14252insG (bảng
3.4).
* Tỷ lệ các biến đổi phối hợp của gen TP53
Chúng tôi thống kê tỷ lệ các mẫu ung thư da có các biến đổi phối hợp
của từng đoạn gen và trên toàn bộ gen TP53 đã phân tích. Hầu hết các mẫu
ung thư da các loại đều có từ 2 biến đổi trở lên.
70 Kết quả ở bảng trên cho thấy: đột biến ở exon 6 chỉ xuất hiện ở các mẫu ung thư tế bào đáy. Không thấy đột biến exon 6 xảy ra với các mẫu ung thư tế bào vảy và ung thư tế bào hắc tố. Các đột biến exon 6 của các mẫu ung thư tế bào đáy đều là đột biến đồng hợp tử, các đột biến này gây thay đổi trình tự mã hóa các acid amin. Có 7 mẫu bị đột biến đồng thời ở cả hai vị trí g.14060G>T và g.14062C>A, hai vị trí này trên exon 6 liên quan đến 1 bộ ba mã hóa (GGC, mã hóa acid amin là Glycine), khi đồng thời hai đột biến xảy ra, bộ ba mã này bị đổi thành TGA, chuyển thành mã kết thúc (hình 3.10). * Biến đổi ở đoạn IVS6 Kết quả biến đổi xảy ra ở IVS6 gặp với tần suất cao, trong đó ung thư tế bào đáy cũng chiếm chủ yếu các biến đổi ở IVS6, tiếp đó là ung thư tế bào vảy và cuối cùng là ung thư tế bào hắc tố. Mặc dù các biến đổi IVS ở ung thư tế bào hắc tố ít, nhưng là toàn bộ các mẫu xảy ra cùng một biến đổi. Các biến đổi ở dạng thay thế nucleotid tại vùng intron là vùng không mã hóa nên về mặt lý thuyết sẽ không ảnh hưởng tới sự phiên mã và hậu phiên mã. Tuy nhiên trong số 35 biến đổi IVS6, có 3 biến đổi chèn thêm nucleotid trên đoạn gen là g.14245-14246insG, g.14247-14248insG và g.14251-14252insG (bảng 3.4). * Tỷ lệ các biến đổi phối hợp của gen TP53 Chúng tôi thống kê tỷ lệ các mẫu ung thư da có các biến đổi phối hợp của từng đoạn gen và trên toàn bộ gen TP53 đã phân tích. Hầu hết các mẫu ung thư da các loại đều có từ 2 biến đổi trở lên.
71
Bảng 3.11. Biến đổi phối hợp các điểm trên gen TP53 ở các loại
ung thƣ da
Số biến
đổi phối
hợp
UT TB
đáy
(n=21)
UT TB
vảy
(n=21)
UT TB
hắc tố
(n=21)
Tổng (n=63)
n
%
1
4
0
0
4
6,3
2
7
5
0
12
19,0
3
1
3
0
4
6,3
4
1
4
0
5
7,9
5
1
4
0
5
7,9
6
6
0
0
6
9,5
9
0
1
0
1
1,6
10
0
0
21
21
33,3
13
1
0
0
1
1,6
14
0
1
0
1
1,6
15
0
1
0
1
1,6
19
0
2
0
2
3,2
Tổng
21
21
21
63
100
Kết quả ở bảng trên cho thấy có tới 93,7% các mẫu ung thư da có từ 2
biến đổi trở lên trên gen TP53, trong đó có 41,3% có từ 10 biến đổi trở lên và
có 2 mẫu ung thư da tế bào vảy có tới 19 biến đổi trên gen TP53.
71 Bảng 3.11. Biến đổi phối hợp các điểm trên gen TP53 ở các loại ung thƣ da Số biến đổi phối hợp UT TB đáy (n=21) UT TB vảy (n=21) UT TB hắc tố (n=21) Tổng (n=63) n % 1 4 0 0 4 6,3 2 7 5 0 12 19,0 3 1 3 0 4 6,3 4 1 4 0 5 7,9 5 1 4 0 5 7,9 6 6 0 0 6 9,5 9 0 1 0 1 1,6 10 0 0 21 21 33,3 13 1 0 0 1 1,6 14 0 1 0 1 1,6 15 0 1 0 1 1,6 19 0 2 0 2 3,2 Tổng 21 21 21 63 100 Kết quả ở bảng trên cho thấy có tới 93,7% các mẫu ung thư da có từ 2 biến đổi trở lên trên gen TP53, trong đó có 41,3% có từ 10 biến đổi trở lên và có 2 mẫu ung thư da tế bào vảy có tới 19 biến đổi trên gen TP53.
72
3.2.2. Kết quả xác định biểu lộ protein p53 đột biến bằng phương pháp
hóa mô miễn dịch
3.2.2.1. Một số hình ảnh đột biến protein p53 trong mô ung thư da.
Hình 3.13. Hình ảnh biểu lộ protein p53 âm tính
(độ phóng đại 200 lần)
Hình 3.14. Hình ảnh biểu lộ protein p53 dƣơng tính (+)
(độ phóng đại 200 lần)
Tế bào
dương
tính
Tế bào
âm tính
72 3.2.2. Kết quả xác định biểu lộ protein p53 đột biến bằng phương pháp hóa mô miễn dịch 3.2.2.1. Một số hình ảnh đột biến protein p53 trong mô ung thư da. Hình 3.13. Hình ảnh biểu lộ protein p53 âm tính (độ phóng đại 200 lần) Hình 3.14. Hình ảnh biểu lộ protein p53 dƣơng tính (+) (độ phóng đại 200 lần) Tế bào dương tính Tế bào âm tính
73
Hình 3.15. Hình ảnh biểu lộ protein p53 dƣơng tính (++)
(độ phóng đại 200 lần)
Hình 3.16. Hình ảnh biểu lộ protein p53 dƣơng tính (+++)
(độ phóng đại 200 lần)
Tế bào
dương
tính
Tế bào
dương
tính
73 Hình 3.15. Hình ảnh biểu lộ protein p53 dƣơng tính (++) (độ phóng đại 200 lần) Hình 3.16. Hình ảnh biểu lộ protein p53 dƣơng tính (+++) (độ phóng đại 200 lần) Tế bào dương tính Tế bào dương tính
74
3.2.2.2. Kết quả xác định protein p53 đột biến trong mô ung thư da
Bảng 3.12. Tỷ lệ biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thƣ da
Các loại UT da
Số lƣợng
Đột biến
gen TP53
Biểu lộ p53
đột biến
Tỷ lệ %
UT TB đáy
21
14
14
66,7
UT TB vảy
21
3
3
14,3
UT TB hắc tố
21
0
0
0
Tổng số
63
17
17
27,0
Bảng trên cho thấy, tỷ lệ biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thư
da 27,0%. Trong đó tỷ lệ đột biến cao nhất loại ung thư tế bào đáy
14/21 mẫu, sau đó ung thư tế bào vảy 3/21 mẫu, không phát hiện được
biểu lộ protein p53 đột biến các mẫu ung thư tế bào hắc tố. Ở các mẫu có
đột biến gen TP53 ở các vùng exon thì ở đều có biểu lộ protein p53 trong mô
ung thư da. Các mẫu chỉ biến đổi các vùng intron thì không phát hiện
được biểu lộ protein p53 đột biến ở trong mô.
3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN BRAF (V600E) CÁC
MẪU UNG THƢ DA
3.3.1. Phân tích đột biến gen BRAF (V600E) bằng phương pháp giải trình
tự gen
3.3.1.1. Kết quả khuếch đại gen BRAF
Với các mẫu DNA được tách chiết từ ung thư da, chúng tôi tiến
hành đồng thời khuếch đại các đoạn gen TP53 gen BRAF, kết quả thu
được đoạn gen BRAF kích thước tương đồng với đoạn gen thiết kế
171bp (hình 3.17).
74 3.2.2.2. Kết quả xác định protein p53 đột biến trong mô ung thư da Bảng 3.12. Tỷ lệ biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thƣ da Các loại UT da Số lƣợng Đột biến gen TP53 Biểu lộ p53 đột biến Tỷ lệ % UT TB đáy 21 14 14 66,7 UT TB vảy 21 3 3 14,3 UT TB hắc tố 21 0 0 0 Tổng số 63 17 17 27,0 Bảng trên cho thấy, tỷ lệ biểu lộ protein p53 đột biến trong mô ung thư da là 27,0%. Trong đó tỷ lệ đột biến cao nhất là ở loại ung thư tế bào đáy 14/21 mẫu, sau đó là ung thư tế bào vảy 3/21 mẫu, không phát hiện được biểu lộ protein p53 đột biến ở các mẫu ung thư tế bào hắc tố. Ở các mẫu có đột biến gen TP53 ở các vùng exon thì ở đều có biểu lộ protein p53 trong mô ung thư da. Các mẫu chỉ có biến đổi ở các vùng intron thì không phát hiện được biểu lộ protein p53 đột biến ở trong mô. 3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN BRAF (V600E) Ở CÁC MẪU UNG THƢ DA 3.3.1. Phân tích đột biến gen BRAF (V600E) bằng phương pháp giải trình tự gen 3.3.1.1. Kết quả khuếch đại gen BRAF Với các mẫu DNA được tách chiết từ mô ung thư da, chúng tôi tiến hành đồng thời khuếch đại các đoạn gen TP53 và gen BRAF, kết quả thu được đoạn gen BRAF có kích thước tương đồng với đoạn gen thiết kế là 171bp (hình 3.17).
75
1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10
Hình 3.17. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ gen BRAF (171bp)
Kết quả phân tích biến đổi V600E của gen BRAF trong mô ung thư da, tất cả
các mẫu ung thư tế bào đáy ung thư tế bào vảy đều dạng wild type
(không có đột biến), vị trí codon 600 vẫn là mã GTG, hóa cho acid amin
Valine (V). Nếu đột biến thì vị trí mã 600, bộ 3 GTG biến đổi nucleotid ở vị
trí giữa Thymine Adenine, tạo thành GAG, hóa cho acid amin
Glutamate (V600E). Chỉ có 1 mẫu ung thư tế bào hắc tố phát hiện thấy có đột
biến V600E. Kết quả phân tích đột biến V600E 63 mẫu ung thư da, được
trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.13. Tỷ lệ đột biến gen BRAF ở các mẫu ung thƣ da
Các loại UT da
Số lƣợng
Biến đổi BRAF
Tỷ lệ %
UT TB đáy
21
0
0
UT TB vảy
21
0
0
UT TB hắc tố
21
1
4,8
Tổng số
63
1
1,6
171bp
75 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 Hình 3.17. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ gen BRAF (171bp) Kết quả phân tích biến đổi V600E của gen BRAF trong mô ung thư da, tất cả các mẫu ung thư tế bào đáy và ung thư tế bào vảy đều ở dạng wild type (không có đột biến), vị trí codon 600 vẫn là mã GTG, mã hóa cho acid amin Valine (V). Nếu đột biến thì vị trí mã 600, bộ 3 GTG biến đổi nucleotid ở vị trí giữa Thymine  Adenine, tạo thành GAG, mã hóa cho acid amin Glutamate (V600E). Chỉ có 1 mẫu ung thư tế bào hắc tố phát hiện thấy có đột biến V600E. Kết quả phân tích đột biến V600E ở 63 mẫu ung thư da, được trình bày trong bảng sau: Bảng 3.13. Tỷ lệ đột biến gen BRAF ở các mẫu ung thƣ da Các loại UT da Số lƣợng Biến đổi BRAF Tỷ lệ % UT TB đáy 21 0 0 UT TB vảy 21 0 0 UT TB hắc tố 21 1 4,8 Tổng số 63 1 1,6 171bp
76
Kết quả ở bảng trên cho thấy, 63 mẫu ung thư da, trong đó gồm ung
thư tế bào đáy, ung thư tế bào vảy và ung thư tế bào hắc tố chỉ phát hiện thấy
có 1 đột biến V600E của gen BRAF ở trạng thái dị hợp tử ở 1 mẫu ung thư tế
bào hắc tố.
3.3.1.2. Một số hình ảnh phân tích gen BRAF
Chiều ngược (reverse): CAC
Hình 3.18. Trình tự ngƣợc chiều (reverse) gen phân tích
của các mẫu ung thƣ da
Hình 3.19. Hình sắp xếp nucleotid của gen BRAF ở các mẫu ung thƣ da
76 Kết quả ở bảng trên cho thấy, 63 mẫu ung thư da, trong đó gồm ung thư tế bào đáy, ung thư tế bào vảy và ung thư tế bào hắc tố chỉ phát hiện thấy có 1 đột biến V600E của gen BRAF ở trạng thái dị hợp tử ở 1 mẫu ung thư tế bào hắc tố. 3.3.1.2. Một số hình ảnh phân tích gen BRAF Chiều ngược (reverse): CAC Hình 3.18. Trình tự ngƣợc chiều (reverse) gen phân tích của các mẫu ung thƣ da Hình 3.19. Hình sắp xếp nucleotid của gen BRAF ở các mẫu ung thƣ da
77
A B
A: Wild type (GTG: V600); B: Đột biến T
A (GAG: E600)
Hình 3.20. Đột biến gen BRAF (V600E) ở bệnh nhân ung thƣ
tế bào hắc tố
3.3.2. Kết quả xác định protein BRAF (V600E) trong mô ung thư da
3.3.2.1. Hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch đột biến BRAF(V600E).
Hình 3.21. Hình ảnh nhuộm HMMD có kết quả
đột biến BRAF(V600E) âm tính (độ phóng đại 200 lần).
Tế bào
âm tính
77 A B A: Wild type (GTG: V600); B: Đột biến T  A (GAG: E600) Hình 3.20. Đột biến gen BRAF (V600E) ở bệnh nhân ung thƣ tế bào hắc tố 3.3.2. Kết quả xác định protein BRAF (V600E) trong mô ung thư da 3.3.2.1. Hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch đột biến BRAF(V600E). Hình 3.21. Hình ảnh nhuộm HMMD có kết quả đột biến BRAF(V600E) âm tính (độ phóng đại 200 lần). Tế bào âm tính